[发明专利]一种高效重组痘苗病毒载体及其建立方法

权利要求书

1.一种高效重组痘苗病毒载体，其特征在于，其为中国天坛株痘苗病毒缺失TK基因并插入EGFP基因的重组病毒。

2.根据权利要求1所述的高效重组痘苗病毒载体，其特征在于，采用CRISPR-Cas9技术敲除中国天坛株痘苗病毒TK基因。

3.根据权利要求2所述的高效重组痘苗病毒载体，其特征在于，通过转染gRNA-Cas9质粒获得重组病毒或者通过gRNA-Cas9细胞系获得重组病毒。

4.根据权利要求3所述的高效重组痘苗病毒载体，其特征在于，病毒转染用细胞为293T细胞或Hela细胞。

5.根据权利要求1所述的高效重组痘苗病毒载体的建立方法，其特征在于，该方法通过转染gRNA-Cas9质粒获得重组病毒。

6.根据权利要求5所述的高效重组痘苗病毒载体的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)gRNA-Cas9质粒的构建与鉴定

设计靶向TK区的gRNA序列；通过分子克隆方法将px330中Cas9的核定位信号NLS缺失，然后将靶向TK区的gRNA序列导入px330-delNLS，获得带有胞质定位Cas9并靶向TK的gRNA质粒；在293T细胞中转染px330-delNLS、px330-delNLS-gRNA，48h后裂解细胞，通过WesternBlot检测；

(2)重组质粒pJ2R-EGFP的构建与鉴定

在293T细胞中感染天坛株痘苗病毒VTT，2h后，转染pJ2R-EGFP质粒；48h后，免疫荧光观察EGFP的表达，构建的重组质粒pJ2R-EGFP主要包括P7.5、P11启动子、EGFP和TK区同源臂；

(3)重组病毒VACV-ΔTK-EGFP的筛选

在293T细胞密度为60％～70％时，转染gRNA-Cas9质粒；24h后，用DMEM稀释野生型病毒，感染细胞；2h后，转染pJ2R-EGFP；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，收获重组病毒悬液，在Vero细胞中利用病毒噬斑形成实验进行多轮筛选，最终获得纯的重组病毒；

(4)重组病毒VACV-ΔTK-EGFP的鉴定

提取步骤(3)纯的重组病毒DNA，然后利用PCR扩增验证，再根据PCR产物测序，确证重组病毒在VTT的TK区准确插入EGFP基因。

7.根据权利要求1所述的高效重组痘苗病毒载体的建立方法，其特征在于，该方法通过gRNA-Cas9细胞系获得重组病毒。

8.根据权利要求7所述的高效重组痘苗病毒载体的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)gRNA-Cas9质粒的构建与鉴定

设计靶向TK区的gRNA序列；通过分子克隆方法将Lenti-V2中Cas9的核定位信号NLS缺失，然后将靶向TK区的gRNA序列导入

Lenti-V2-delNLS，获得带有胞质定位Cas9并靶向TK的gRNA质粒；在293T细胞中转染Lenti-delNLS、Lenti-delNLS-gRNA，48h后裂解细胞，通过Western Blot检测；

(2)Cas9蛋白在gRNA细胞系中的表达

经过嘌呤霉素筛选，最终获得的gRNA-Cas9细胞系中，利用Western Blot检测；

(3)重组病毒的纯化

在293T gRNA-Cas9细胞系感染野生型病毒；2h后，转染pJ2R-EGFP；4h后，换成2％FBS的培养基。48h后，收获重组病毒悬液；在Vero细胞中利用病毒噬斑形成实验进行多轮筛选，最终获得纯的重组病毒；

(4)重组病毒验证

提取步骤(3)纯的重组病毒DNA，然后利用PCR扩增验证，再根据PCR产物测序，确证重组病毒在VTT的TK区准确插入EGFP基因。