[发明专利]吮噬虫SSU rRNA基因及其引物在检测吮噬虫中的应用及检测吮噬虫的试剂盒和方法

说明书

本发明涉及吮噬虫的特异性检测领域，公开了吮噬虫SSU rRNA基因及其引物在检测吮噬虫中的应用及检测吮噬虫的试剂盒和方法，本发明的检测方法对吮噬虫的检测特异性强、灵敏度高，最低浓度可达到7.851拷贝/μl SSU rRNA基因的存在；利用本发明的方法对栅藻培养系统中的吮噬虫进行基因组DNA的提取并定量监测，最终得到的总拷贝数与显微镜计数得到的数量变化趋势是基本一致，以上结果说明本发明建立的荧光定量PCR方法具有高效性和重复性。此外，该方法反应快速，检测过程相对简单，可以快速高效的用于微藻培养系统中出现的吮噬虫。而且随着技术的不断发展，实时荧光定量PCR所用的仪器会越来越简便，快速，成本降低。

技术领域

本发明涉及吮噬虫的特异性检测领域，具体涉及吮噬虫SSU RRNA基因在特异性检测吮噬虫中的应用、特异性扩增吮噬虫SSU RRNA基因的引物对、特异性检测吮噬虫的试剂盒以及在栅藻培养过程中特异性检测吮噬虫污染的方法。

背景技术

微藻培养过程中不可避免的出现各种污染物，其中原生动物及轮虫对微藻的危害最为严重，被认为是导致微藻培养失败的主要原因，有文献估计由浮游动物污染导致的生产力年度亏损范围为15-20％(Richmond,Boussiba et al.1993)。由此可见，生物污染物成为微藻大规模培养的一大障碍且严重地限制了工业化进程(Wang,Zhang et al.2013)。有研究表明，摄食微藻的纤毛虫、变形虫、轮虫和其他浮游动物对自然生态系统有着很大的影响，而在微藻培养的生态领域当中，这一工作并没有引起广泛的关注或报道。了解人工跑道池的生态学将有助于降低微藻大规模培养的风险，但这方面鲜有人研究。

吮噬虫是栅藻大规模培养中存在的一种污染最严重的原生动物，作为一种对栅藻培养危害极大的种类，最早在室外跑道池和管道二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)的大规模培养中被发现(Gong,Patterson et al.2015)。吮噬虫对栅藻培养的危害极大，一旦栅藻被其感染，4天内微藻生物量就会减产100％，而其对S.dimorphus也危害极大，可使微藻减产80％-90％。在美国，二形栅藻在开放式跑道池中大规模培养时，吮噬虫会全年出现，尤其是夏季；而在中国燕郊镇栅藻在封闭式管道大规模培养中，吮噬虫的爆发发生在2016年6月，温度和pH分别在26-28℃和6.4-6.6之间。因此对于栅藻大规模培养中吮噬虫的早期快速监测和分子鉴定方法的确定至关重要。

目前对吮噬变形虫研究多局限于对其进行形态观察以及其对蓝藻的吞噬习性方面的研究，而对其进行早期监测方面的研究甚少。当前不同的监测方法主要考虑产量、使用的仪器、所需的人力和成本。显微镜观察是最早被用于监测的手段，主要通过形态学来区分污染物。这种方法效率较低，必须具备区分不同物种的专业知识(Fulbright,Dean etal.2014)。而且根据污染物种的大小，需要用到不同的生物计数框，对于很小的物种，显微镜通常无法观测到，同时血球计数板计数要求污染物最低数量达到10⁴细胞/mL才能准确计算细胞数。随着科学技术的日益革新，FlowCAM被大力推广，有能力识别和鉴定在非常密集的N.oculata中的捕食者(纤毛虫，变形虫和异养鞭毛藻)。然而，该系统仅能够监测到密度大于10细胞/mL的培养物，并且不能区分形态大小相似的细胞(Day,Thomas et al.2012)。其中一个关键点在于，如果想利用FlowCAM监测微藻培养里的污染物，首先需要建立污染物种库，不同的微藻处理方法也不同。尽管监测效率增加，但是对于形态小大相似的物种识别非常有限。这两种都是在污染物达到一定量值可以得到很好利用的监测方法，但在我们需要进行及时控制污染物的发生可能为时过晚。因此，建立一种早期监测微藻培养系统中的污染物，对于有效培养优良微藻是必不可少的。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供了吮噬虫SSU rRNA基因在特异性检测吮噬虫中的应用，同时提供了吮噬虫SSU rRNA基因的特异性引物，以及特异性检测吮噬虫的试剂盒和方法，本发明的技术方案能够快速、简单、高灵敏度和特异性的检测微藻培养过程中吮噬虫的污染。