[发明专利]哺乳动物细胞表达载体及其构建方法与应用

说明书

本发明提供一种哺乳动物表达载体，采用SV40核心启动子作为筛选基因的启动子，结合筛选基因密码子非最优化并以核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列代替筛选基因起始密码子前Kozak序列的设计，改变筛选基因的翻译、转录水平，确保载体上的筛选基因的低水平表达，从而在该载体整合至宿主细胞的基因组之后，只有整合在适合外源基因高表达的位置的细胞株才能存活，不仅能够有效降低筛选细胞的数量，并且能够提高所筛选得到细胞株的表达能力。

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种哺乳动物细胞表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

蛋白质在合成过程中要经过翻译后的加工和修饰，才能成为有活性的蛋白质，其中，翻译后加工过程包括：磷酸化、糖基化、二硫键形成、酰基化和蛋白酶加工等。原核细胞不具备翻译后加工的能力，因此，原核细胞在表达真核生物蛋白时效果。酵母，植物，昆虫细胞虽然能对重组蛋白进行糖基化修饰，但其糖基化方式与哺乳动物细胞不同，有可能产生免疫原性。因此，开发以哺乳动物细胞、尤其是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)为宿主，获得高水平生产性细胞株的载体成为本领域的当务之急。

其中，采用CHO细胞表达既能保证重组蛋白质的正确糖基化和磷酸化，又能保证重组蛋白二硫键的正确配对和蛋白质的正确折叠，从而使由CHO细胞表达的重组蛋白与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物学功能。但是在一般情况下，外源基因在CHO细胞中的表达量很低，很难用于实际工业化生产，而且需要大量筛选细胞株，获得高产细胞株的效率较低。因此，有必要构建一种可使外源基因在哺乳动物细胞中获得高效、高水平的表达的表达载体系统。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种哺乳动物细胞表达载体，使外源基因在哺乳动物细胞中获得高效、高水平的表达。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种哺乳动物细胞表达载体，所述哺乳动物细胞表达载体包括有：筛选基因表达框和目的基因表达框；

所述筛选基因表达框包括筛选基因启动子和筛选基因序列组成；

所述筛选基因启动子为SV40核心启动子；所述筛选基因序列的5’端连接有如SEQID NO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列。

本发明的另一个目的是提供一种哺乳动物细胞表达载体的构建方法，具体技术方案如下：

一种哺乳动物细胞表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建筛选基因表达框：所述筛选基因启动子为SV40核心启动子；所述筛选基因序列的5’端连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列；

(2)合成表达载体中除筛选基因表达框外的其他部分，所述表达载体中除筛选基因表达框外的其他部分中包含有目的基因表达框以及复制子；

(3)将所述筛选基因表达框与表达载体中除筛选基因表达框外的其他部分连接，即得哺乳动物细胞表达载体。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明通过发明人大量创造性劳动，采用SV40核心启动子作为筛选基因的启动子，结合筛选基因密码子非最优化并以核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列代替筛选基因起始密码子前Kozak序列的设计，构建得到一种筛选基因表达框和目的基因表达框的哺乳动物细胞表达载体，改变筛选基因的翻译、转录水平，确保载体上的筛选基因的低水平表达，从而在该载体整合至宿主细胞的基因组之后，只有整合在适合外源基因高表达的位置的细胞株才能存活，不仅能够有效降低筛选细胞的数量，并且能够提高所筛选得到细胞株的表达能力。

附图说明

图1为真核表达载体pMCS的质粒图谱；