[发明专利]一种人成体神经干细胞的制备方法及其防治脑卒中的用途

权利要求书

1.一种人成体神经干细胞系的建立，其中包括神经干细胞的培养方法和传代方法两个步骤：

1).神经干细胞条件培养基来源：当神经干细胞培养3-4天约半数神经球直径超过150μm或培养7-9天约半数神经球直径超过250μm时，吸出半量培养基，加入等量的新鲜培养基，放回细胞培养箱继续培养。将上述吸出的培养基，500G/min离心5分钟，上清即为神经干细胞条件培养基，保存4℃备用；

2).细胞培养瓶预处理：取适量神经干细胞条件培养基孵育新的细胞培养瓶8h，备用；

3).神经干细胞球的消化与传代：培养7-9天、半数神经球直径超过250μm时，500g/min离心5分钟，再将神经干细胞球重悬于Accutase消化液中，置于37℃水浴消化5分钟，超净台机械吹打15-20下，水浴消化3min，加入胰酶抑制剂终止消化，继续吹打15-20下，可见细胞球变小并多为单细胞，500g/min离心5分钟。取出神经干细胞条件培养基预处理过的细胞培养瓶，吸弃其中的培养基，将神经干细胞基础培养基与条件培养基1∶1混合，之后采用此混合培养基重悬消化后的神经干细胞，并按1∶3传代接种于预处理过的细胞培养瓶，并于CO₂细胞培养箱中培养。传代3-4天后，进行半量换液。

4).重复此方法进行神经干细胞的传代和培养，建立稳定的神经干细胞系。

2.根据权利要求1-2任意一项所述的一种神经干细胞系的建立方法，其特征在于，所述神经干细胞培养基由基础培养基、B27、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、腐胺、Notch 1、WNT3a、黄体酮、亚硒酸钠、胰岛素生长因子、层粘蛋白组成；B27为1×，表皮生长因子浓度15-25ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子浓度15-25ng/ml，胰岛素5-15mg/ml，腐胺12-18mg/L，Notch 140-60nmol/L，WNT3a 10-30nmol/L，黄体酮10-30nmol/L，亚硒酸钠2-7ug/L，胰岛素生长因子20-30mg/ml，层粘蛋白2-8μg/ml，所述基础培养基由DMEM/F12、HEPES和碳酸氢钠组成，其中，HEPES浓度为15-25mmol/L，碳酸氢钠浓度为15-20mmol/L。

3.根据权利要求1-3任意一项所述的一种人神经干细胞系的建立方法，其特征在于，其包括细胞冻存步骤。所述细胞冻存步骤为：

细胞传代后7-9天进行细胞冻存，将神经干细胞收集至离心管中，500g离心5分钟，收集细胞；将收集到的细胞重悬于细胞冻存液(DMEM/F12培养基：人白蛋白：二甲基亚砜＝7：2：1)中，冻存密度5×10⁶/ml；将冻存细胞置于异丙醇冻存盒中，-80℃过夜；将细胞转移至液氮罐中长期保存。

4.通过权利要求1-3任意一项所述的一种人神经干细胞系的建立方法所建立的人神经干细胞系作为治疗脑卒中药物中的应用。

5.通过权利要求1-3任意一项所述的一种人神经干细胞系的建立方法所建立的人神经干细胞系分化所得的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞作为治疗脑卒中药物中的应用。