[发明专利]一种鉴定海滨木槿HhCLA1基因的VIGS沉默体系及其构建方法和应用

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种鉴定海滨木槿1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合成酶基因HhCLA1的VIGS沉默体系及其构建方法和应用，通过构建含有HhCLA1基因片段的pTRV2病毒沉默表达载体质粒，借助叶片注射法转化海滨木槿，诱导海滨木槿内源HhCLA1发生沉默，有效降低了海滨木槿HhCLA1基因的表达水平，导致白化表型。本发明方法建立了TRV‑VIGS沉默海滨木槿内源基因从而鉴定基因功能的体系，具有快速，高通量，易于操作等优势，为开展海滨木槿基因功能研究提供了新途径。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种鉴定海滨木槿HhCLA1基因的VIGS沉默体系及其构建方法和应用。

背景技术

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是基于植物抗病毒侵染的自然机制开发的研究基因功能的新工具，现已成为一种快速鉴定植物基因功能的反向遗传学技术。利用VIGS技术可以抑制植物中目的基因表达。与基因敲除、突变体筛选等植物分子生物学技术相比，VIGS技术无需通过组织培养再生植株或生产转基因植株进行研究，具有周期短、易操作、效率高、成本低以及高通量等优点。目前，VIGS技术已广泛应用于植物非生物胁迫、生长发育等相关方向基因功能研究。相较草本植物，木本植物的遗传转化体系较难建立，且即使建立了成熟的遗传转化体系，生长速度慢、周期长等因素仍严重制约了木本植物基因功能研究。VIGS技术的研发有望促进木本植物基因功能鉴定。

植物中建立VIGS体系，可选用1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因（cloroplastoalterados，CLA1）作为报告基因。CLA1是类胡萝卜素合成途径的限速酶基因，与胡萝卜素积累密切相关。本发明构建了携带海滨木槿HhCLA1干扰片段的烟草脆裂病毒（TRV）重组载体，通过农杆菌介导成功侵染海滨木槿，建立了高效VIGS体系，为海滨木槿功能基因组学研究提供了技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、高效、低成本研究海滨木槿基因功能的新方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

海滨木槿1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HhCLA1，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

海滨木槿1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HhCLA1的VIGS病毒载体，由所述的海滨木槿1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HhCLA1与VIGS病毒载体构成。

一种鉴定海滨木槿HhCLA1基因的VIGS沉默体系的构建方法，包括以下步骤：

（1）设计引物HhCLA1-ZF和HhCLA1-ZR，以海滨木槿cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，扩增上游引物和下游引物分别引入EcoR I和Sac I酶切位点，HhCLA1-F序列为SEQ IDNO.2，下游引物HhCLA1-R序列为SEQ ID NO.3；

所述特异性引物的序列为：

HhCLA1-F：CTGTGAGTAAGGTTACCGAATTCTCATGTTGTCACTGAGAAAGG