[发明专利]蛋白激酶A催化亚基TPK1基因改造方法及其应用

说明书

本发明提供一种真核生物的基因改造方法，通过基因编辑对3’5’‑环腺苷酸依赖的蛋白激酶，即蛋白激酶A催化亚基的TPK1编码基因进行碱基突变，从而将该真核生物的TPK1氨基酸序列中与酿酒酵母TPK1氨基酸序列179号位点相对应的丝氨酸突变为天冬氨酸，即237号位点的丝氨酸突变为天冬氨酸。该改造方法不仅能够增强真核体外生物合成体系起始蛋白质翻译效率，更主要的是能够增加体外生物合成体系针对不同蛋白质合成的可能性。同时，本发明提供包含利用该基因改造方法进行改造的基因工程细胞，以及包含该基因工程细胞制备的细胞提取物的真核无细胞蛋白质合成体系。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及通过蛋白激酶A催化亚基的氨基酸点突变，调控无细胞蛋白质合成体系中外源蛋白的合成效率。

背景技术

大部分蛋白在合成过程中经过蛋白质翻译后修饰，一些不合适的修饰常常与疾病相关。蛋白质磷酸化是一种广泛的翻译后修饰，大约30%的蛋白组可以被磷酸化[1]。蛋白质磷酸化在第二信使传递和酶的级联作用中起到关键作用，很多最基础的生物过程如信号传导、基因表达和细胞分裂等都受到蛋白磷酸化的调控，是原核和真核生物中重要的调控修饰形式之一[2]。蛋白质的磷酸化位点在肽链的氨基酸残基上，如酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸等。这些氨基酸残基本身不带电荷，在侧链加入带有强负电荷的磷酸基团后，蛋白质的构型和活性进而发生变化[3]。蛋白质磷酸化是在一系列蛋白激酶的催化作用下完成的。

3’5’-环腺苷酸依赖的蛋白激酶( cAMP-dependent protein kinase)，即蛋白激酶A（protein kinase A，PKA)，最早在1968年被识别和纯化，是蛋白激酶家族中重要的一类丝/苏氨酸蛋白激酶[4]。信号分子与质膜上受体结合后，通过G蛋白偶联受体（Gi或Gs）调节腺苷酸环化酶（AC）的活性。AC催化ATP生成cAMP从而控制cAMP的含量，进而决定蛋白激酶PKA的活性。由PKA负责细胞内很多不同类型的蛋白质磷酸化，从而调节生物代谢和基因表达。比如在有营养的状态下，通过Ras-cAMP的信号通路，促进细胞的营养生长。

PKA全酶结构是特殊的四聚体，由两个催化亚基（C）和两个调节亚基（R）组成。催化亚基含有水解ATP的活性位点和一个结合调节亚基的结构域。调节亚基含有可以结合cAMP的结构域[5]。在没有cAMP时，催化亚基的活性被调节亚基所抑制，因此四聚体全酶结构下的PKA没有活性。4个cAMP分子可以分别结合两个调节亚基，引起PKA激酶的构象变化，导致两个催化亚基的脱离。在ATP存在时，没有调节亚基结合抑制的催化亚基即可开始磷酸化含有Arg-Arg-X-Ser/Thr序列的丝/苏氨酸蛋白[6]。在酿酒酵母中，PKA激酶的调节亚基是BCY1基因所编码，催化亚基是由三个功能上部分重复的基因所编码，分别为TPK1, TPK2, TPK3。在葡萄糖的刺激下，cAMP/PKA通路被激活，TPK1的Ser179位点的自磷酸化增加，从而导致PKA激酶的活性增强。TPK1的自磷酸化机制有效地调控了在葡萄糖存在下的PKA活性[7]。

在酵母中，PKA信号通路在对营养物质的反应上对细胞生长有着重要的作用。在细胞被破碎前，被Ser179的自磷酸化激活的PKA促进细胞生长。而将丝氨酸突变为天冬氨酸，处于PKA持续激活状态下的细胞被制备成裂解液以后，可能有效改变蛋白质的体外合成的效率。鉴于此，我们以克鲁维酵母菌作为试验菌株，模拟丝氨酸的自磷酸化作用，从而判断其是否对无细胞蛋白合成体系中的外源蛋白合成效率有影响。

参考文献如下：

1.Ptacek et al., Global analysis of protein phosphorylation in yeast.Nature, 2005. 438: 679-684.

2.Hunter T. Signaling-2000 and beyond. Cell, 2000. 100:113-127.