[发明专利]一种生产ω-1-羟基脂肪酸的方法

说明书

本发明公开了一种生产ω‑1‑羟基脂肪酸的方法。以NADH类似物依赖型的细胞色素P450为生物催化剂，以NADH类似物为辅因子，催化底物脂肪酸次末端C‑H羟基化，生成ω‑1‑羟基脂肪酸。NADH类似物依赖型的细胞色素P450可用于与再生NADH类似物的再生酶及对应再生底物偶联催化下，利用NAD类似物为辅因子，生成ω‑1‑羟基脂肪酸。该NADH类似物依赖型细胞色素P450酶可用于构建生物正交的不依赖天然辅因子NADPH的合成羟化脂肪酸的代谢途径，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)类似物依赖型细胞色素P450生产ω-1-羟基脂肪酸，具体地说，是经基因工程改造的P450 BM3，以NAD(H)类似物为辅因子，催化脂肪酸羟基化，并应用到构建生物正交的脂肪酸羟基化代谢途径，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。

背景技术

ω-羟基脂肪酸是在精细化工领域具有广泛应用的脂肪族衍生物，可用于生产可降解聚合材料、表面活性剂、化妆品成分及食品添加剂等，目前主要以蓖麻油、大豆油等油料作物为原料进行脂肪酸化学羟化，但存在选择性低、合成路线复杂等突出问题，尤其是国内外迄今尚未实现C12-C18羟基脂肪酸的商业化生产(翁佩芳，吴祖芳.中国粮油学报，2008，23：203-206)。而细胞色素P450单加氧酶可选择性催化脂肪酸羟基化生成-羟基脂肪酸，具有反应条件温和、原料可再生、反应选择性高等特点(Kang，M.K.，and Nielsen，J.JInd Microbiol Biotechnol，2017，44：613-622.)。

细胞色素P450酶是一类功能多样的硫醇盐-亚铁血红素酶蛋白，可选择性活化C-H键、N-H键、S-H键等，从而催化20余种不同类型的反应，实现对大量不同结构底物的选择性羟化、环氧化、脱烷基等修饰性反应，被誉为自然界的“万能催化剂”。P450 BM3是来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的脂肪酸羟化酶，是目前文献报道催化效率最高的P450酶，催化效率高达17000min-1，包括含有血红素的P450结构域和P450还原酶结构域的融合的双功能自给自足型P450酶。野生型P450 BM3利用NADPH和O₂催化脂肪酸次末端亚甲基羟基化生成ω-1(or 2 or 3)-羟基脂肪酸，而P450 BM3 F87A脂肪酸羟基化产物只有ω-1-羟基脂肪酸(Christopher J.C.Whitehouse，et al.P450 BM3(CYP102A1)：connectingthe dots.Chem Soc Rev，2012，41，1218-1260)。但其生物转化体系仍存依赖还原型辅酶和宿主底物供给能力弱等问题，严重制约其工业化应用。