[发明专利]一种生产ω-1-羟基脂肪酸的方法

权利要求书

1.一种生产 ω-1-羟基脂肪酸的方法，其特征在于：以 NADH 类似物依赖型的细胞色素 P450 酶为生物催化剂，以 NADH 类似物为辅因子，催化底物脂肪酸中与ω-甲基连接CH₂ 羟基化，生成ω-1-羟基脂肪酸；

细胞色素P450 酶为来源于巨大芽孢杆菌Bacillusmegatherium的自己自足型P450BM3（CYP102A1），编码基因为 SEQ ID NO：1的基因序列，其编码的蛋白质为 SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

NADH 类似物依赖型细胞色素P450 酶为在 SEQ ID NO：2 的氨基酸 序 列 基 础 上的 多 位 点 突 变 体 ， 突 变体 选自 P450 BM3-R967D/K973S 、 P450 BM3-R967D/K973S/Q977F 、 P450

BM3-R967D/K973S/Q1005H；

NADH 类似物为NCDH、 NTDH 和NUDH 中的一种或两种以上，其化学结构如下：

。

2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：NADH 类似物NCDH、NTDH或NUDH是由酶法或化学法还原NCD、NTD 或NUD而得，

NCD、NTD 和NUD 的化学结构如下：

。

3.按照权利要求 2 所述的方法，其特征还在于：酶法还原 NCD、NTD 或 NUD 的再生酶为苹果酸酶 ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶 PDH-I151R 或甲酸脱氢酶FDH-G171Y 中的一种或两种以上；

所述再生 NADH 类似物的氧化还原酶对应再生底物为苹果酸化合物，亚磷酸化合物，D-乳酸化合物，甲酸化合物中的一种或两种以上；其中，苹果酸化合物为苹果酸、苹果酸盐中的一种或两种；D-乳酸化合物为 D-乳酸、D-乳酸盐中的一种或两种；亚磷酸化合物为亚磷酸、亚磷酸盐中的一种或两种；甲酸化合物为甲酸、甲酸盐中的一种或两种；

所述酶法再生 NADH 类似物的反应体系为 pH 7.5 的缓冲液中， NAD 类似物 1 mM-20mM，再生酶 10 U-500U，再生底物 4mM-25 mM，20℃-40℃下反应 20min-2 h；其中，缓冲体系为MES、Tris-HCl、磷酸盐或HEPES 缓冲液中的一种或两种；

化学法还原 NCD、NTD 和 NUD 中的一种或两种以上的反应体系为水溶液，还原剂为Na₂S₂O₄、NaBH₄、NaBH(Et)₃、NaBH₃CN 中的一种或两种以上的任意比例组合，其中 NAD 类似物与还原剂的比例为 1：2-4，20℃-40℃下反应 20 min - 2h。

4.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：底物脂肪酸为 C12-C18饱和脂肪酸中的一种或两种以上的任意组合。

5.根据权利要求 1 所述的生产 ω-1-羟基脂肪酸的方法，其特征在于： 在pH 5-9 的缓冲体系中， NADH 类似物依赖型细胞色素P450 酶以NADH 类似物为辅因子，催化 C12-C18 脂肪酸次末端 C-H 羟基化，生成 ω-羟基脂肪酸；其中，缓冲体系为MES、Tris-HCl、磷酸盐或 HEPES 缓冲液中的一种或两种以上。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在 pH 5-9 的缓冲体系中，NADH 类似物依赖型细胞色素 P450 酶，偶联再生 NADH 类似物的苹果酸酶 ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶 DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶 PDH-I151R 或甲酸脱氢酶 FDH-G171Y 及对应再生底物，催化 C12-C18 脂肪酸次末端 C-H 羟基化，生成 ω-羟基脂肪酸；其中，缓冲体系为MES、Tris-HCl、磷酸盐或 HEPES 缓冲液中的一种或两种以上。