[发明专利]基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法

说明书

本发明公开了基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法，包括样本DNA序列破碎、修复序列平末端、序列末端加上串联条形码接头、修复序列空缺并延伸和PCR扩增的步骤构建DNA文库；其中串联条形码为6bp长度的DNA序列，且同时满足最小编辑长度3以内、包含不同碱基的片段、使用不同激光色的碱基且相邻碱基激光色不同和不含有AAA、ACA、CCC、CAC、GGG、GTG、TTT和TGT的碱基序列。通过提前引入串联条形码进行DNA标记，大大减少污染数据不能被识别的可能性，极大改善在DNA文库构建和基因富集过程中非常普遍的样本之间相互污染问题。

技术领域

本发明涉及分子标记，涉及DNA文库标记，具体涉及一种基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法。

背景技术

在使用Illumina方法进行测序时，目前通用DNA文库构建的步骤为破碎、修复平末端、加上IS7、IS8引物识别位点接头、补足接头与序列之间出现的空缺，最后进行indexingPCR时为序列加上条形码以便区分样本，测序后得到的数据根据此条形码进行分类。但是，上述方法在整个实验步骤最后加上条形码，如果在之前的步骤中样本之间发生相互污染，则无法区分数据是属于哪个样本。

现有技术中，专利申请(CN107502607A)公开了一种大量组织、细胞样本mRNA的分子条形码标记、文库构建、测序的方法，用于反转录mRNA，合成cDNA时进行标记，但不适用于DNA文库构建。专利(CN104573407B)公开了一种物种特异性内源性条形码的搜索方法及其在多样本混合测序中的应用，通过重叠延伸PCR技术，利用样本内源DNA序列的差异对PCR产物进行标记，与DNA文库构建无关，也没有包括条形码标记技术。目前，DNA样本间交叉污染现象非常严重，对后续数据的组装和分析造成很大困扰和隐患。

发明内容

为克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于Illumina测序的串联条形码、其标记的DNA文库及其构建方法，在文库构建初期即加入可以区分样本的串联条形码(Inline Index)接头，通过串联条形码标记构建DNA文库，准确区分不同DNA样本。相对于传统的分子条形码技术，不仅纠正受到污染的数据，还大大增加条形码组合的数量用于区分更多样本，节约成本。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，基于Illumina测序的串联条形码为6bp长度的DNA序列，且同时满足

(ⅰ)最小编辑长度3以内，和

(ⅱ)包含不同碱基的片段，和

(ⅲ)使用不同激光色的碱基，且相邻碱基激光色不同，和

(ⅳ)不含有'AAA'、'ACA'、'CCC'、'CAC'、'GGG'、'GTG'、'TTT'和'TGT'的碱基序列。

优选的，所述串联条形码包括IS1串联条形码、IS2串联条形码和与所述IS1串联条形码和IS2串联条形码对应的IS3串联条形码。

且所述IS3串联条形码与所述IS1串联条形码和IS2串联条形码之间分别具有部分互补片段。

优选的，所述IS1串联条形码包括IS1序列和与所述IS1序列具有部分互补片段的IS3X’序列，通过在95℃以0.1℃/秒的速率降温至12℃，所述IS1序列和所述IS3X’序列结合形成所述IS1串联条形码。

优选的，所述IS2串联条形码包括IS2序列和与所述IS2序列具有部分互补片段的IS3Y’序列，通过在95℃以0.1℃/秒的速率降温至12℃，所述IS2序列和所述IS3Y’序列结合形成所述IS2串联条形码。

第二方面，通过上述串联条形码标记的DNA文库的构建方法，具体地，包括以下步骤：