[发明专利]一种定量检测窖泥中甲烷菌含量的方法

说明书

本发明属于生物技术及食品发酵领域，是一种涉及利用特异性引物定量检测浓香型白酒窖泥中甲烷菌的方法，本发明针对目标甲烷菌在某个分类层面(门纲目科属种六个分类层面均可以)上16S rDNA的特异性，设计出目标甲烷菌的特异性引物。该方法包含以下步骤：(1)目标甲烷菌特异性引物的设计；(2)不同窖泥样本的采集及其宏基因组提取；(3)利用目标甲烷菌特异性引物对上述基因组样本进行QPCR(quantitative polymerase chain reaction)扩增来定量检测不同浓香型白酒窖泥样本中甲烷菌的含量。本发明基于目标甲烷菌16S rDNA的特异性SNP(single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)和SAP(simple allele discriminating PCR)技术设计属特异性PCR(polymerase chain reaction)引物的方法，提供了一种可行的从复杂菌群中利用特异性引物检测甲烷菌的分子生物学方法。

技术领域

本发明属于生物技术及食品发酵领域，是一种涉及特异性引物定量检测浓香型白酒窖泥中甲烷菌的方法。

背景技术

在白酒的酿造过程中，窖泥作为微生物的载体，发挥着重要的作用。窖泥中的各种微生物在发酵的厌氧条件下相互维持着群落的平衡，形成特殊的生态系统，对于酒类的发酵程度和风味塑造起着决定性的作用。随着分子生物学的发展，由于16S rRNA基因在物种进化过程中具备高度保守性，人们积极利用16S rRNA基因来确定微生物门纲目种属等分类学信息，对未培养或不能培养的微生物16S rRNA基因进行PCR扩增成为了主要的方法，特别是极端环境下生长的微生物，例如甲烷菌。甲烷菌是专性严格厌氧菌，生长繁殖特别缓慢，培养分离比较困难，在实验室模拟它们的生长条件是很困难的；而在以往对浓香型白酒窖泥菌群的系列分析结果表明，甲烷菌在产香等发酵过程中具有重要作用，所以需要对其进行深入研究。

甲烷菌属在浓香型白酒窖泥中的含量分布情况比较类似，既有的检测报道一般是3-6个属。比如五粮液酒的窖泥中曾报道了4个优势甲烷菌属，分别为Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanoculleus和Methanosarcina，其中Methanosarcina可同时利用乙酸和H₂。四川绵阳丰谷酒业的窖泥中含有至少5个甲烷菌属，分别是Methanoculleus(甲烷袋状菌属,本文称之为甲烷囊菌属，参见百度百科)、Methanosarcina(八叠球菌属)、Methanobacterium(甲烷杆菌属)、Methanocorpusculum(甲烷粒菌属)和Methanomicrobiaceae(甲烷微菌属)。四川泸州某公司白酒生产窖池中发现至少有6个甲烷菌属，分别是Methanobrevibacter、Methanosata、Methanoculleus、Methanobacterium、Methanocorpusculum和Methanothri，而泸州老窖的百年窖泥中至少含有4类不同的甲烷菌属，分别是甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷鬃菌属(Methanosaeta)和甲烷囊菌属(Methanoculleus)。显然，不同的浓香型白酒在日常质控过程中需要对不同组合的甲烷菌属设计特异性(快速)检测技术。

甲烷菌的特异性检测已经有不少报道。比如，韦艳霞等人试图研究根管感染中产甲烷古细菌的多样性，利用甲基辅酶M还原酶(methyl coenzyme M reductase，MCR)基因α亚基(mcrA)的特异性引物，发现所选样本中产甲烷古细菌的多样性局限于类口腔甲烷短杆菌序列型。华金玲等也是利用MCR基因特异性基因引物发现黄淮白山羊瘤胃中的甲烷菌主要是瘤胃甲烷杆菌。兰阿峰等利用甲烷菌16S rDNA特异性引物Met86F和Met1340R测定了野生秦岭羚牛瘤胃中甲烷菌种类，发现包括了至少3个科，若干个属，其多样性比较丰富。