[发明专利]一种基于胍基化标记的蛋白质N端肽段反向富集的方法

说明书

本发明涉及一种基于胍基化标记的蛋白质N末端肽段反向富集的分析方法及应用，包括赖氨酸ε‑氨基及多肽N端氨基的胍基化标记、胍基化试剂的去除，胍基化赖氨酸C端肽键的胰蛋白酶酶切及非蛋白质N末端肽段的选择性去除。首先建立能够高效胍基化标记赖氨酸ε‑氨基及多肽N端氨基的标记条件及过量标记试剂的选择性去除，然后将优化好的标记条件用于蛋白质中的N端氨基和赖氨酸ε‑氨基胍基化标记，利用氨基活性材料与酶切产生肽段的N端氨基反应，从而实现蛋白质N端肽段反向富集。本发明的优点是高效的赖氨酸ε‑氨基及肽端N段氨基胍基化标记、高效的离子化率，提高了蛋白质N端肽段反向富集率及鉴定深度。

技术领域

本发明涉及一种基于胍基化标记的蛋白质N-端肽段反相分析方法，提高蛋白质N-端信息的鉴定灵敏度和鉴定深度。

背景技术

蛋白质N端在蛋白质合成过程中生成，并在合成后被广泛修饰，如N-末端启动子甲硫氨酸去除和N-末端乙酰化修饰，以及通过特异性水解转化为成熟有活性的蛋白质。特异性的蛋白水解处理产生新的蛋白质形态，这些新形态可能会显著地改变蛋白质的稳定性、活性及功能，如caspase-1或caspase-11活化后，可特异性切割GSDMD蛋白2个结构域之间的连接区域，释放的N端结构域可识别并结合细胞膜上的磷脂类分子，在细胞膜上打孔，导致细胞渗透压变化，细胞膜胀大裂解引发细胞焦亡(Nature 2015，526，660–665)。基于质谱的蛋白质组学是研究蛋白质N端理想方法，其基本策略是对蛋白质酶切产生肽段的分析，由于大量的非N端肽段的存在，大大干扰了蛋白质N端肽段的分析，通过降低非N端肽段的比例，提高蛋白质N端肽段的鉴定灵敏度，对研究蛋白质N端及N端的翻译共修饰所具有的生物功能具有重要的意义。

目前，反相富集策略是研究蛋白质N端肽段主要方法，通过在蛋白质水平对赖氨酸的ε-氨基及蛋白质的N端氨基进行二甲基化、乙酰化等化学标记，然后利用蛋白酶对蛋白质进行水解，水解产生的肽段含有N端氨基，利用能够与氨基反应的活性颗粒或带有标签的氨基活性试剂与水解产生的N端氨基反应，选择性去除水解得到的中间肽段，实现蛋白质N端的肽段的选择性富集(Methods Mol Biol 2017，1574，51-76；Nature Biotechnology2010,28,281-288)。由于蛋白质的赖氨酸ε-氨基被二甲基化、乙酰化等标记后，胰蛋白酶无法对赖氨酸进行酶切，将会产生严重的酶漏切率，使得酶切得到的肽段过长，利用质谱进行分析时，二级碎片信息复杂，不利于鉴定；同时蛋白质N端被二甲基化、乙酰化等标记后，不利于肽段的离子化，进一步干扰了蛋白质N端肽段的鉴定。

针对目前基于质谱技术的蛋白质N端肽段分析存在的胰蛋白酶漏切及离子化抑制的科学问题，通过实现蛋白质赖氨酸ε-氨基和N端的胍基化标记，显著提高标记N端肽段的离子化效率；并通过实验证实，胰蛋白酶能够高效酶切胍基化标记的赖氨酸，显著性降低胰蛋白酶的漏切率，提升肽段的解析能力，从而提高蛋白质N-端信息的鉴定灵敏度和鉴定深度。

发明内容

本发明发展了一种蛋白质N-端肽段反相分析方法，本发明的优点是高效的赖氨酸ε-氨基及肽端N段氨基胍基化标记、高效的离子化率、高效的酶切率及高效的氨基去除率，提高蛋白质N端肽段反向富集率及鉴定深度。

为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1、蛋白质赖氨ε-氨基及蛋白质N段氨基胍基化标记

将蛋白进行变性、还原、烷基化后，加入终浓度为2mM-2M的1H-吡唑-1-甲脒，使用强氧化钠、三乙胺、二异丙基乙基氨等不含自由氨基的碱调节pH为9.5-12.5，于25-99℃振荡反应10min-24h，得溶液A；

2、通过蛋白质沉淀或者滤膜的方法去除过量的胍基化试剂

1)通过蛋白质沉淀的方法去除过量的胍基化试剂