[发明专利]一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药性检测方法

说明书

本发明涉及一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药性检测方法，其步骤如下：（1）收集副溶血弧菌活菌体1.0~1.2g，用7~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；（2）将该模板与氟喹诺酮类药物耐药基因检测引物GyrA‑F、GyrA‑R、GyrB‑F、GyrB‑R、ParE‑F和ParE‑R共同混合后，进行PCR扩增；（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并测序。本发明的检测方法敏感、特异、快速，可以检测极微量的目的基因，不需经过费时的副溶血弧菌培养。

技术领域

本发明涉及病原菌检测技术领域，具体涉及一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法。

技术背景

氟喹诺酮类药物对G-杆菌，包括绿脓杆菌均有良好抗菌作用，对G+球菌也具一定抗菌活性。国内外研究表明，由于氟喹诺酮药物长期和大量使用，副溶血弧菌对氟喹诺酮类药物的耐药性十分严重，严重影响了临床疗效。已经发现的氟喹诺酮耐药基因有：GyrA,GyrB, ParC, ParE等。我国副溶血弧菌耐药性检测传统方法是通过测定副溶血弧菌的最低抑菌浓度或抑菌圈大小测定副溶血弧菌的耐药性，必须经过繁琐的副溶血弧菌分离、纯化、繁殖、扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于临床上及时的选药治疗。同时，药敏试验是在体外用药物试探性的检验副溶血弧菌的表型耐药特性，不能检测副溶血弧菌的隐型耐药性。

发明内容

本发明提供一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药性检测方法。

本发明的具体步骤如下：

（1）收集副溶血弧菌活菌体1.0~1.2g，用7~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~15min后收集上清液，得到模板。

（2）将该模板与氟喹诺酮类药物耐药基因检测引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.3~0.5mmol/L的dNTP、终浓度为0.3~0.5mmol/L的GyrA-F、终浓度为0.3~0.5mmol/L的GyrA-R、终浓度为0.5~0.8mmol/L的GyrB-F、终浓度为0.5~0.8mmol/L的GyrB-R、终浓度为0.5~0.6mmol/L的ParE-F、终浓度为0.5~0.6mmol/L的ParE-R和终浓度为0.02~0.03U/uL的TaqDNA聚合酶，其中GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R分别如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR缓冲液的10倍母液中包括10~20mM氯化钾、pH8.3的12mMTris-HCl和0.01~0.02%氯化钠，20~30mM MgCl₂；

（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并测序。

在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.4mmol/L的dNTP、终浓度为0.4mmol/L的GyrA-F、终浓度为0.4mmol/L的GyrA-R、终浓度为0.7mmol/L的GyrB-F、终浓度为0.7mmol/L的GyrB-R、终浓度为0.5mmol/L的ParE-F、终浓度为0.5mmol/L的ParE-R和终浓度为0.02U/uL的TaqDNA聚合酶。

在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR缓冲液的10倍母液中包括15mM氯化钾、pH8.3的12mMTris-HCl和0.01%氯化钠，30mM MgCl₂。