[发明专利]基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系方法

说明书

本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系的方法，将靶向Egr2基因的打靶载体与打靶供体共转HEK293细胞系，使携带荧光素酶报告基因的打靶载体在Egr2基因组下游目标位点处正确重组，重组基因受内源性Egr2基因启动子的调控，获得单一稳定的Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系，并验证Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否能真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化。为毛发生长和中枢神经系统相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。

技术领域

本发明属于生物技术和药理学领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas9 靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的新方法。

背景技术

早期生长反应蛋白2(Early growth response protein2，Egr-2)属于即刻早期基因家族，Egr2可与富含GC序列的靶基因启动子特异序列结合具有转录激活作用，为转录因子。Egr2属于一个小的蛋白质亚家族，该家族还包括早期生长反应基因1(EGR-1，又名krox-24、Zif268、NGFI-A和 TIS8)、早期生长反应基因3(EGR-3)和神经生长因子诱导的克隆C(nerve growth factor-induced clone C,NGFI-C)，这些蛋白可以与相似的DNA序列结合，但其作用的结构域不同。Egr2基因有4种转录本，编码2种亚型蛋白：转录本1～3编码亚型a，转录本4编码亚型b。Egr2基因结构在小鼠、鸡和人中都高度保守。Egr2基因编码的蛋白含有3个锌指结构：N-末端保守性较高；C-末端保守性较差；主要是以锌指结构与特异DNA序列结合，与该基因转录激活或抑制功能有关。

研究发现，Egr2是多条信号通路调节的靶蛋白，一般被激活后会参与调控某些下游基因的表达，进而影响细胞或个体的生理功能。Egr2是施旺细胞(Schwann cell)的标志因子，也是一个调节髓鞘化的重要因子。在后脑发育、肿瘤抑制、外周神经髓鞘形成及单核细胞命运决定中都发挥着重要作用。Egr2本身的表达又受到诸多上游信号通路如Wnt、FGF等信号通路的调节，进而影响下游基因表达。

头发是哺乳动物特有的专用表皮附属物。毛茸茸的大衣在温度调节中扮演着重要的角色，同时也起到伪装的作用。一些毛发，如胡须，已经演变为触觉器官，对动物行为很重要。在人类中，头发不那么重要，并且通常更多地被视为美容优势。毛囊提供了角质形成细胞的储库，它可以被募集到皮肤缺损的再上皮化。在胎儿期间，毛发从原始表皮发育而来。Egr2在毛囊分化中发挥重要作用，据研究报道，Egr2在毛基质中的表达会引起毛轴不同的分化特征。此外，Egr2在脂肪形成、施旺细胞及中枢神经系统的发育过程中也发挥重要作用。

CRISPR是广泛存在于细菌和古细菌基因组中的规律成簇间隔短回文重复序列。CRISPR/Cas9系统是由最简单的type ll CRISPR改造而来，该系统由单链的guide RNA和有核酸内切酶活性的Cas9蛋白构成。sgRNA将会引导编码的Cas蛋白(具有DNA核酸酶和解旋酶的活性)对靶基因DNA进行识别和特异性切割。所以通过人工设计具有引导作用的sgRNA(short guide RNA)，可以引导Cas9对宿主细胞DNA进行定点切割，然后通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(homologous recombination，HR)两种修复途径的机制进行修复，实现基因编辑。

目前，基于细胞转录激活检测的报告基因系统，是建立药物筛选模型的常用手段。传统检测基因表达调控的方法主要是通过RT-PCR、Western Blot 和将目标基因启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中等手段来实现。这些方法要么费时，繁琐，要么难以准确反映基因组上基因表达情况。