[发明专利]一种无血清无DMSO组织工程骨冻存液及其制备和冻存方法

说明书

本发明涉及一种组织工程骨冻存液及其制备和冻存方法。本发明摒弃了DMSO和动物血清等常用的冻存液成分，而是采用以alpha‑MEM基础培养液为基质，联用了安全性较高的丙二醇、聚乙二醇、维生素C和谷氨酰胺。避免了DMSO对细胞的潜在化学毒性反应，也避免了血清传播动物源性病原体及病毒污染的风险。而且，采用本发明的冻存液，组织工程骨冻存的效果好，细胞复苏后活率高。冻存12周后，用本发明冻存液冻存的组织工程骨，复苏后细胞活率为90％以上，细胞增殖不改变、并维持成骨分化表型。

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程骨冻存液及其制备和冻存方法。

背景技术

由于创伤、感染、畸形矫正与肿瘤切除等导致的大面积骨缺损临床常见，目前自体骨移植虽然是临床治疗的金标准，但是存在供区损伤和供体不足的缺陷。组织工程骨的构建与缺损修复可以替代自体骨移植，从而为克服这一问题开辟了新的途径。作为成体干细胞的一种，脂肪干细胞具有易取材、扩增能力强，具有多向分化潜能等优势。研究证明，脂肪干细胞可以稳定的向成骨细胞诱导分化，可以作为一种理想的种子细胞进行组织工程骨的构建。脱钙骨是一种传统的骨修复材料，具有良好的三维空间结构，能够保证细胞有充足的生长空间，作为组织工程的支架材料得以广泛应用。但是由于组织工程骨的体外构建耗时不能即刻应用，因而寻找一种合适的保存方法成为解决问题的关键。在骨组织的冻存中，虽然自体骨冻存的颅骨骨瓣修复应用于临床的报道。但是组织工程骨的保存报道较少，而且效果存在很大的差异。玻璃化冻存相对于慢速冻存而言，由于无冰晶形成，可以阻止冰晶破坏细胞膜和细胞器，保证细胞存活。目前玻璃化冻存在冻存组织工程血管，卵巢组织，胰腺组织中取得了初步成效。

细胞的冻存过程会显著改变细胞的化学、物理和热力学环境，伴随有造成细胞生物性结构损伤的危险。为了将细胞在冻存、复苏过程中的损伤降至最低，必须进一步优化化学和温度操作过程，但需要在冻存前加入一种或一种以上的细胞冻存保护剂，在复苏后又将其去除。目前，最常用的冻存保护剂为二甲基亚砜(DMSO)，这种物质具有分子量小，溶解度大，易穿透细胞的特点，可使冰点下降，减少细胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。由于高浓度DMSO对细胞有毒性，还必须添加其他的液体成分，如血清、细胞培养基，以降低DMSO的浓度，减少对细胞的伤害。另外，DMSO作为一种高致癌物，其在细胞产品中的应用势必会给病人带来潜在的致癌隐患。

在目前的报道的细胞冻存液配方中，多采用DMSO联合动物血清，大部分为10％的DMSO与90％的胎牛血清，但由于DMSO含量仍较高，具有相当的毒性，对病人身体不利，并且胎牛血清中含有大量的异种蛋白，既有动物病原污染的危险，又很容易引起过敏反应或者免疫排斥，因此临床直接回输有很大的风险。并且，虽然目前国内外对干细胞或组织的冻存具有多种方案，但是对于组织工程骨这一特定的细胞材料复合物的冻存仍存在重重困难。因而存在寻找冻存组织工程骨的效果好同时危险性低的新型冻存液的需要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种组织工程骨冻存液及其制备方法和应用，该组织工程骨冻存液不含DMSO和血清成分。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种无血清无DMSO的组织工程骨冻存液，其特征在于，所述组织工程骨冻存液以不含血清的培养基为基质，冻存液中包括以下组分：丙二醇、聚乙二醇、维生素C和谷氨酰胺，余量为培养液。

作为优选，每100mL所述组织工程骨冻存液的组分含量满足以下(a)-(d)中一个或多个条件：

(a)所述丙二醇为5mL-16mL，更优选5mL-12mL；

(b)所述聚乙二醇为5g-30g，更优选5g-20g；

(c)所述维生素C为5mg-150mg，更优选10mg-120mg；或

(d)所述谷氨酰胺为30mg-500mg，更优选50mg–150mg。