[发明专利]分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。本发明以E.coli MG1655为出发菌株，提供了一种在大肠杆菌中表达全长IgG抗体的方法，同时共表达了分子伴侣，促进全长IgG的正确形成，提高IgG抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。

背景技术

单克隆抗体是生物制药行业最重要的组成部分之一，尤其是在自身免疫性疾病和肿瘤领域占据主要地位。截止2013年，有35种单克隆抗体获得美国FDA的批准，其中，免疫球蛋白G(IgG)占绝大多数。因此，人们对IgG的生产最为关注。

单克隆抗体是一个由轻链LC和重链HC组装成的异四聚体蛋白质。根据不同的重链，可以将单克隆抗体分成5类免疫球蛋白：IgG、IgM、IgD、IgA和IgE。IgG抗体是由两个相同重链(HC)和两个相同轻链(LC)组成的对称抗体，每一个都通过二硫键相连。

EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一，是原癌基因C-ERBB1的表达产物。EGFR可以在细胞核中积累聚集，并对细胞增殖、DNA修复、肿瘤发生、炎症等产生影响。截止2017年1月，共有10种以EGFR为靶点的药物获得FDA批准上市，包括4种大分子药物(cetuximab、nimotuzumab、panitumumab和necitumumab)和6种小分子药物(erlotinib、gefitinib、lcotinib、afatinib、osimertinib和olmutinib)。

Cetuximab(西妥昔单抗)由德国默克里昂制药公司生产，主要用于治疗结肠直肠癌，商品名为爱必妥，是针对EGF受体的IgG单克隆抗体。它的前身抗体225是通过杂交瘤技术产生的。西妥昔单抗与人EGFR的细胞外结构域结合，竞争性阻断受体与天然配体的结合，如EGF和TGF-α。较高亲和力的西妥昔单抗阻止EGFR形成其开放的活性构象和二聚化，造成EGFR的磷酸化和后续信号级联的蛋白质减少。西妥昔单抗与EGFR特异性结合后，会阻断细胞内信号转导途径，进而抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞的凋亡。

目前，在大肠杆菌中成功表达全长IgG抗体的例子有限。2002年，Simmons等人发表在Journal of Immunological Methods上的文献Expression of full-lengthimmunoglobulins in Escherichia coli:rapid and efficient production ofaglycosylated antibodies.首次实现了在大肠杆菌中表达全长IgG单克隆抗体，并优化了IgG的轻链和重链的比例，从而获得高产IgG的大肠杆菌工程菌株。2007年，Yarv M等人发表在Nature Biotechnology上的文献Isolation of engineered,full-length antibodiesfrom libraries expressed in Escherichia coli.公开了构建IgG单抗的组合文库系统，筛选出高产IgG的大肠杆菌突变菌株。

分子伴侣是一类蛋白质，它能够识别并结合折叠不完全的蛋白质，帮助多肽的正确转运、折叠。折叠酶和周质空间伴侣蛋白是常见的分子伴侣，它们的共表达可以防止蛋白质的聚集，并提高周质空间中重组蛋白质的表达量。表达抗TNF抗体Fab片段的重组大肠杆菌工程菌这篇中文专利于2016年申请公布，该专利公开了多个分子伴侣如DsbC、PPIB、Skp等分子伴侣对Fab表达的影响。

然而，在大肠杆菌中共表达抗EGFR抗体IgG的多种分子伴侣中，哪种分子伴侣最适合，可以最大化提高IgG的表达量并且促进完整IgG的形成，需要大量的实验研究确定。

发明内容