[发明专利]一种乳酸菌菌种长期保藏方法

说明书

本发明公开了一种乳酸菌菌种长期保藏方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)配制γ‑聚谷氨酸溶液与甘油混合，制成γ‑聚谷氨酸‑甘油混合溶液；(2)制作棉球，灭菌备用；(3)制备乳酸菌菌种液；(4)将步骤(2)制作的棉球浸入步骤(3)的乳酸菌种液中，将吸附有菌液的棉球置于离心管中，再用无菌注射器注入步骤(1)中配制的γ‑聚谷氨酸‑甘油混合液至装满离心管，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品低温保藏。使用该方法进行乳酸菌的保藏，可以将保藏年限延长至10‑15年，乳酸菌的存活率可高达90％以上，保藏后的菌种恢复活性应用方便，恢复后菌种活性与原始菌种几乎相同。

技术领域

本发明涉及微生物菌种保藏领域，具体涉及一种乳酸菌菌种长期保藏方法。

背景技术

微生物菌种的保藏是从事微生物研究工作遇到的一个重要问题，现有的一些菌种保藏方法，在菌种保藏过程中往往需要经常地活化传代，菌种保藏工作复杂而繁琐，且常常因保藏不当造成菌种丢失，给工作带来极大的不便。

保藏菌种的原理主要是依据微生物的生理代谢特点，创造一种外部条件，使微生物细胞代谢处于停滞、不活跃、生长繁殖受抑制的休眠状态，但细胞并不死亡，遇到适宜的条件又可马上复活。通常采用低温冷冻、干燥缺氧、营养缺乏等方法，或几种方法并行使用，使菌种暂时处于休眠状态。理想的保藏方法除了长期保持菌种原有的优良性状不变外，保藏方法本身的简便易操作也非常重要，同时还要考虑保藏成本的经济性，以便能使保藏方法被广泛使用。

菌种是从事微生物学研究及发酵工业生产的基本材料，也是国家的重要资源。菌种保藏就是采用最合适的保存方法，使菌种的变异和死亡减少到最低限度的一项经常性工作。

目前，微生物菌种的保藏方法主要有以下几种：

①定期移植法：就是将菌种接种于适宜的培养基中，在最适条件下培养，待生长到一定阶段后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养。此法操作简单，但保存时间短，需要经常移种，易于变异，只能作为菌种的短期保藏。

②液体石蜡保藏法：该方法是首先将优质化学纯液体石蜡进行灭菌，然后把灭菌后的液体石蜡注入已长好菌的斜面上，使菌种与空气隔绝。试管直立置于冰箱(4～6℃)低温保存。保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。此方法主要用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏，保藏期1-2年。缺点是必须直立存放，占空间大，不便携带，并且某些以石蜡为碳源，或对液体石蜡保藏敏感的菌株都不能用此法保藏。

③沙土管保藏法：该方法为取60～80目河沙和非耕作层贫瘠且粘性较小的土，用吸铁石吸去铁质，用10％盐酸浸泡24h后弃盐酸，分别用水洗至中性，将沙土烘干备用。将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，塞好棉塞，灭菌备用。把制备好的菌悬液分装每支沙土管0.5mL，放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。塞好棉塞放入盛有干燥剂的容器中，用真空泵抽去水分。存放于低温(4～6℃)干燥处保藏，每隔半年验证1次。本法方法简便，设备简单，适用于产孢子和有芽孢的菌种保藏，可保存2年,但对营养细胞不适用。

④真空冷冻干燥保藏法：该方法分为好氧菌冷冻干燥保藏和厌氧菌冷冻干燥保藏。此方法是国际菌种保藏机构通常采用的方法之一，应用最为广泛，几乎所有的微生物均可采用此法保藏。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。方便之处在于因冷冻干燥管无需低温保藏，所以运输方便，但此法所需设备要求高，操作复杂，费用昂贵，且恢复应用时不方便。

⑤冷冻保藏法：此法存活率高，稳定性强，保藏时间长，是长期保藏菌种的较好方法。适用于各种菌种的保藏，特别适用于难以用真空干燥保藏等方法保藏的菌种。但此法需定期向液氮罐中补充液氮，以保证液氮罐中的温度，要求条件高，操作复杂，保藏成本较高，且恢复应用时不方便。