[发明专利]一种组织和细胞冻存液及其冻存方法

说明书

本发明涉及一种组织和细胞冻存液及其冻存方法，具体公开了一种神经细胞或组织冻存液，其包含全神经培养基，二甲基亚砜以及血清；所述全神经培养基为Neurobasal培养基、谷氨酰胺的衍生物和细胞培养添加剂的组合物。本发明冻存液可有效冻存原代神经组织，保证神经元复苏活性。本发明适用于人或小鼠等实验动物的脑神经组织冻存，也适用于其他类似神经细胞那样不易冻存的细胞组织的冻存。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种组织和细胞冻存液及其冻存方法。

背景技术

在神经生物学研究中，原代神经元的分离培养，是基础研究及转化研究的重要研究工具，不过由于神经元细胞缺乏增殖能力，一次原代分离后，有多余组织细胞不可长时间保存等原因，限制了神经组织的充分利用，因此，若能冻存未使用多余出的神经组织，不仅可节约分离成本，也可最大的使用样本材料。

细胞冻存是低温保存技术，可以使细胞暂停生长而被保存起来，需要的时候再复苏使用。从而起到细胞保种的作用。便于细胞的交换和运送。细胞冻存液中常会加入终浓度5％-15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，在缓慢冻结条件下，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。目前对于各种细胞系的保存方法通常采用冻存方法保存，然而对于正常原代细胞(例如神经细胞)的保存，通常存在细胞的冻存损伤，进而导致复苏后无法继续存活或者培养效率低等问题。另一方面，对于组织样品的冻存实施难度更大，因为在冷冻过程中存在更大程度的组织细胞中冰晶形成的破坏作用。常用的组织冻存通常是进行分子生物学方面的形态表达分析，而无法获得活的原代细胞。在现有技术中，对于非癌化组织细胞的冻存液研究还很有限。

发明内容

基于现有技术中存在的问题，本发明提供一种神经细胞或组织冻存液，可冻存包括人或实验动物的原代神经元组织。

本发明一个方面提供了一种细胞或组织冻存液，其包含全神经培养基，二甲基亚砜以及血清；所述全神经培养基为Neurobasal培养基、谷氨酰胺的衍生物和细胞培养添加剂的组合物。

在本发明的技术方案中，所述谷氨酰胺的衍生物为GlutaMAXTM，优选为100倍稀释。

在本发明的技术方案中，所述细胞培养添加剂为B27。

在本发明的技术方案中，各组分的比例为全神经培养基60％-80％，二甲基亚砜5％-15％，血清为15％-25％，优选为全神经培养基70％，二甲基亚砜10％，血清为20％。

在本发明的技术方案中，全神经培养基各组分的比例为以体积计90-99％Neurobasal培养基、0.1-5％谷氨酰胺的衍生物和0.5-5％细胞培养添加剂优选为97％Neurobasal培养基、1％谷氨酰胺的衍生物和2％细胞培养添加剂。

在本发明的技术方案中，所述的血清为选自胎牛血清、马血清、羊血清、鸡血清或血清替代物。

在本发明的技术方案中，所述细胞或组织冻存液优选为神经细胞和组织冻存液。

本发明另一个方面提供了一种冻存细胞或组织的方法，其包括以下步骤：

1)将待冻存的组织进行分割，分割后的组织任一边长小于5mm的小块；或者将细胞进行分离；

2)将步骤1)获得的分割后的组织先浸泡于海藻酸钠溶液，再置于氯化钙溶液后，形成一层海藻酸钠钙交联保护层即可；

3)将步骤2)获得的保护后的组织放入权利要求1-5任一项所述细胞或组织冻存液中进行冻存。

所述Neurobasal培养基为Neurobasal培养基。

所述谷氨酰胺的衍生物为100倍稀释的GlutaMAXTM(100X)。

所述细胞培养添加剂B27为20％B27。