[发明专利]一种流穿层析法纯化b型嗜血杆菌荚膜多糖的工艺

说明书

本发明提供一种流穿层析法纯化b型嗜血杆菌荚膜多糖的工艺，包括预处理、串联DEAE‑adhere复合模式层析柱层析、切向流超滤膜包超滤、冷冻干燥步骤。本发明的优点在于减少有机溶媒的使用，减少了对环境及人员的危害。层析柱流穿模式层析配合切向流超滤膜包脱盐使杂质含量更低，且更具生产放大的意义；示差检测器的应用解决了多糖对紫外波长无响应的问题；超滤液直接冷冻干燥获得低含水量的多糖产品，精糖更稳定性。

技术领域：

本发明涉及疫苗生产过程中的多糖抗原的纯化，更具体的说是涉及一种b型嗜血杆菌荚膜多糖的纯化工艺。

背景技术：

多糖类疫苗(包括多糖结合疫苗)的生产过程大致相同，都经过菌种培养、发酵罐发酵、菌体分离、胞外多糖纯化等步骤。当前国际上针对b型嗜血杆菌荚膜多糖纯化普遍采用相同的方法即表面活性剂沉淀发酵液离心后的上清液获得复合多糖、复合多糖乙醇梯度沉淀去除核酸获得粗糖、粗糖酚抽提去除蛋白，乙醇沉淀后旋转蒸发干燥获得精糖。该方法在粗糖制造精糖的过程中，大量使用苯酚与乙醇、丙酮等有机溶媒。它们不仅对环境与生产人员的身体健康产生危害，而且对疫苗使用者的身体健康存在威胁。减少有机溶媒的使用，加强多糖纯化控制具有重要的现实意义。

在中国生物制品学杂志2013年9月第26卷第9期中《层析法纯化脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖工艺的建立》提出了一种利用采用流穿层析模式，经一步层析将多糖与其他杂质分离，再经Sephodex G25脱盐后获得脑膜炎球菌多糖原液的方法。b型嗜血杆菌多糖与脑膜炎球菌多糖化学结构、带电性、分子大小都不同，不能利用该方法纯化获得符合国家药典的b型嗜血杆菌多糖。本专利工艺相比该方法，选择紫外检测器与时差检测器联用，解决了b型嗜血杆菌多糖在紫外-可见光检测无相应的问题；层析过程中，缓冲液中脱氧胆酸钠质量浓度高于1.5％，是实现b型嗜血杆菌多糖流穿的关键；层析后，使用切向流超滤膜包超滤代替Sephodex G-25凝胶柱层析，切向流对多糖损害小、处理量大、耗时短，更具工业应用价值；增加了冻干工艺，直接对超滤浓缩液进行冻干，多糖更稳定。

中国专利CN201210037245.2，专利名为《一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法》，该专利公布了一种利用羟基磷灰石层析进行b型嗜血杆菌多糖纯化的方法。该方法不再使用苯酚进行蛋白去除，采用羟基磷灰石进行多糖纯化，去除蛋白。本专利工艺相比该方法，采用脱氧胆酸钠预处理初步降低了蛋白含量；使用DEAE与adhere复合模式(弱阴离子模式与疏水模式)柱串联，不同于羟基磷灰石层析原理；层析后，使用切向流超滤膜包超滤代替G-25凝胶柱，更具工业应用价值；增加了冻干工艺，直接对超滤浓缩液进行冻干，多糖更稳定。

中国专利CN201210121292.5，发明名称为《b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺》，该专利公布了一种利用离子交换柱层析、高盐洗脱，Sephadex G-25凝胶柱脱盐获得精糖原液的方法。本专利工艺相比该工艺，使用DEAE与adhere复合模式(弱阴离子模式与疏水模式)柱串联，不进行洗脱直接收集流穿溶液，不同于纯阴离子层析原理；层析后，使用切向流超滤膜包超滤代替Sephodex G-25凝胶柱层析，切向流对多糖损害小、处理量大、耗时短，更具工业应用价值；增加了冻干工艺，直接对超滤浓缩液进行冻干，多糖更稳定。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种流穿层析法纯化b型嗜血杆菌荚膜多糖的工艺。

本发明通过预处理-串联DEAE-adhere复合模式层析柱层析-切向流超滤膜包超滤-冷冻干燥的方法进行b型嗜血杆菌荚膜多糖的纯化，减少了有机溶媒的使用，克服了传统工艺的不足，同时能生产出优于国家药典的精糖。

本发明的目的通过以下方案实现：

本发明所述的流穿层析法纯化b型嗜血杆菌荚膜多糖的工艺，包括以下步骤：

1)预处理：将粗多糖充分溶解于Tris缓冲液中，向溶液中添加等体积的脱氧胆酸钠溶液，搅拌6小时以后中空纤维柱过滤，获得过滤液；