[发明专利]一种亚精胺合成酶活性测定试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种亚精胺合成酶活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

试剂一，液体10mL×1瓶，由Na₂HPO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、水组成，4℃保存；

试剂二，液体100mL×1瓶，由Na₂HPO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、β-巯基乙醇、EDTA、磷酸吡哆醛、水组成，4℃保存；

试剂三，液体10mL×1瓶，由试剂二、腐胺、脱羧S-腺苷蛋氨酸组成，4℃保存；

试剂四，液体10mL×1瓶，由高氯酸、水组成，4℃保存；

试剂五，液体10mL×1瓶，由NaOH、水组成，4℃保存；

试剂六，液体10mL×1瓶，由饱和NaHCO₃组成，4℃保存；

试剂七，液体15mL×1瓶，由丹磺酰氯、丙酮组成，4℃保存；

试剂八，液体10mL×1瓶，由氨水组成，4℃保存；

试剂九，液体110mL×1瓶，由高氯酸、水组成，4℃保存；

试剂十，亚精胺标准品×1支，-20℃保存。

2.根据权利要求1所述的亚精胺合成酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂一中含有1.347g Na₂HPO₄·7H₂O、0.386g NaH₂PO₄·2H₂O以及50mL水。

3.根据权利要求1所述的亚精胺合成酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂二中含有2.694g Na₂HPO₄·7H₂O、0.772g NaH₂PO₄·2H₂O、18.3μL β-巯基乙醇、0.0438g EDTA、2.0mg磷酸吡哆醛以及100 mL水。

4.根据权利要求3所述的亚精胺合成酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂三中含有10mL所述试剂二、2.64 mg腐胺以及11.95mg脱羧S-腺苷蛋氨酸。

5.根据权利要求1所述的亚精胺合成酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂四中含有1mL高氯酸以及10mL水。

6.根据权利要求1所述的亚精胺合成酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂五中含有0.8g NaOH以及10mL水。

7.根据权利要求1所述的亚精胺合成酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂七中含有150mg丹磺酰氯以及15mL丙酮。

8.根据权利要求1所述的亚精胺合成酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂九中含有1.25mL高氯酸以及110mL水。

9.根据权利要求1所述的亚精胺合成酶活性测定试剂盒，其特征在于：试剂十中含有0.5mg亚精胺标准品。

10.一种利用如权利要求1所述的试剂盒的亚精胺合成酶活性测定方法，其特征在于，基于高效液相色谱法，具体步骤如下：

步骤1 仪器和用品的准备；

准备高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、氮吹仪、研钵、涡旋振荡器、50个0.22μm有机系针头式过滤器、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、4.6×250 mm的C18柱、可调式移液器、50个2mL样本瓶、50个放置在样本瓶内用于微量样本进样的内衬管、色谱级甲醇和超纯水；

步骤2 检测前的准备工作；

将1000 mL超纯水和1000 mL甲醇分别用0.45μm水系滤膜和0.45μm有机系滤膜抽滤，以除去超纯水和甲醇中的杂质，防止堵塞色谱柱；

将除杂后的甲醇和超纯水分别配制成流动相A和流动相B；

将配好的流动相A和流动相B分别超声30分钟，以脱去流动相A和流动相B中的气泡，防止堵塞色谱柱；

步骤3 亚精胺合成酶的提取；

称取0.2g样本，放入研钵中研磨，加入1mL试剂一，移入EP管内，匀浆，在离心率10000g下离心10min，提取上清液；

取0.1 mL提取后的上清液于棕色离心管中，加入0.2 mL试剂三，室温下混合反应30min，然后加入0.2 mL试剂四，停止反应；

在上述停止反应后的棕色离心管中，依次加入60μL试剂五、60μL试剂六和60μL试剂七，50℃水浴锅内避光反应40min，取出冷却，向其中加入100μL试剂八，室温下静置30min；

对上述静置后的混合溶液用乙醚萃取三次，合并乙醚相，氮吹仪吹干，最后用甲醇定容至0.5mL，制得样本衍生物溶液，然后取适量定容后的样本衍生物溶液用针头式过滤器过滤，最后置于带有内衬管的样本瓶内待测；

步骤4 标准品溶液的配制；

在试剂十中加入1mL试剂九，配成500μg /mL的母液，将母液用试剂九分别稀释成50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL和0.05μg/mL的亚精胺标准品溶液；不同浓度的上述亚精胺标准品溶液均按照步骤3中提取亚精胺合成酶时的衍生方法进行衍生反应，制得亚精胺标准品衍生物溶液，然后取适量亚精胺标准品衍生物溶液用针头式过滤器过滤，最后置于带有内衬管的样本瓶内待测；

步骤5 亚精胺合成酶活性测定的操作步骤；

开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速0.8 mL/min，柱温40℃，保留时间40min，荧光检测器检测波长，Ex=340nm，Em=515nm设置完毕保存方法组；

用流动相冲洗色谱柱以及整套高效液相色谱仪的所有管路，待基线稳定后开始加样

在高效液相色谱仪中，加入不同浓度的亚精胺标准品衍生物溶液10μL，在保留时间内分离目标物，计算不同浓度亚精胺标准品的亚精胺衍生物的峰面积y1；

在高效液相色谱仪中，加入样本衍生物溶液10μL，在相应保留时间处，计算样本的亚精胺衍生物的峰面积y2；

步骤6 亚精胺合成酶活性的计算；

亚精胺衍生物标准曲线：

y=1.0721x-1.0879 R²=0.999；

其中，x为亚精胺衍生物浓度，mmol/L；

y为峰面积；

亚精胺合成酶活性的计算公式：

U(μmol/min/g)=[(y2+1.0879)÷1.0721-(y1+1.0879)÷1.0721]×V_总÷t÷W；

其中，y2为样本的亚精胺衍生物的峰面积；

y1为标准品的亚精胺衍生物的峰面积；

V_总为样本的总体积，单位为mL；

t为精胺合成酶与腐胺反应时间，单位为min；

W为样本鲜重，单位为g。