[发明专利]一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法

说明书

本发明公开了一种利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，通过先对动物胶质瘤肿瘤细胞的冻存细胞进行单克隆培养，然后选用CRISPR‑Cas9基因技术，针对于MDR1设计各自的sgRNA，并将其插入至腺病毒中并在转染细胞中连续PCR扩增，获得大量病毒液，最后将腺病毒价值胶质瘤肿瘤细胞中，敲除对应的基因片段，从而避免了因这些基因片段损伤突变而使胶质瘤细胞产生耐药性，这种方法基因消除效率高，有助于研究胶质瘤肿瘤耐药的机理，研发更有效的抗肿瘤靶向药。

技术领域

本发明属于基因技术领域，特别是一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法。

背景技术

CRISPR是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。目前，CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。

虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，腺病毒载体法是基因治疗中最有前途的基因转移方法之一。载体容易构建和操作，宿主范围广，感染性强，腺病毒载体能有效地将外源基因转移到各种靶细胞或组织中。可经不同途径进入不同组织，能感染分化后的非分裂期细胞，并且腺病毒基因不整合到宿主细胞中，无插入突变激活癌基因的危险，外源基因能游离地表达。近年，腺病毒载体引起了科研人员的关注，广泛用于遗传病、传染病和肿瘤等疾病的基因治疗的研究和应用。

肿瘤具有多基因型的特征，且基因变异驱使肿瘤的恶性发展和化疗耐药，纠正或删除这些变异基因是未来肿瘤治疗发展的一个方向。胶质瘤是源自神经上皮的肿瘤统称为脑胶质瘤，占颅脑肿瘤的40％～50％，是最常见的颅内恶性肿瘤。年发病率为3～8人/10万人口。目前，胶质瘤化疗所选用的主要药物为吉非替尼、厄洛替尼、奥斯替尼等，但在长期使用过程中，部分胶质瘤肿瘤细胞由于基因片段的损伤、突变，产生了耐药性，导致肿瘤化疗失败。经研究发现，导致胶质瘤肿瘤细胞产生耐药性的基因片段主要有MDR1，通过采用基因编辑、敲除等技术，能够敲除这些基因，培育出缺失MDR1等基因片段，从而对上述药物缺乏耐药性的肿瘤细胞模型，是一种胶质瘤的基因治疗的有效辅助手段。然而，目前的基因敲除中，尚未发现有关敲除MDR1基因片段，建立肿瘤模型的技术。

发明内容

本发明提供了一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，具体通过以下技术实现。

一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，包括以下步骤：

A1、取动物胶质瘤肿瘤细胞冻存细胞进行单克隆培养，得胶质瘤肿瘤细胞悬液，备用；

A2、针对MDR1中的蛋白质编码序列，通过CRISPR在线设计工具分别设计针对于MDR1的sgRNA；所述MDR1的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

A3、将各sgRNA分别插入到腺病毒载体中，使其能表达，得重组腺病毒载体；

A4、将重组腺病毒载体转染至转染细胞中，直至出现明显细胞病变后，收集细胞，冻融释放病毒，在转染细胞中连续PCR扩增，获得大量病毒液，分层纯化病毒液，得高浓重组腺病毒载体；

A5、将高浓重组腺病毒载体加至胶质瘤肿瘤细胞悬液中，敲除胶质瘤肿瘤细胞的MDR1基因，得动物肿瘤模型。

优选地，步骤A3中，所述腺病毒载体含有绿色荧光标签蛋白。