[发明专利]一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法在审
| 申请号： | 201811325558.1 | 申请日： | 2018-11-08 |
| 公开（公告）号： | CN109536528A | 公开（公告）日： | 2019-03-29 |
| 发明（设计）人： | 靖超 | 申请（专利权）人： | 武汉纤然生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/861 | 分类号： | C12N15/861;C12N15/90 |
| 代理公司： | 南京纵横知识产权代理有限公司 32224 | 代理人： | 祝蓉蓉;徐瑛 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道6*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 动物肿瘤模型 基因片段 技术构建 肿瘤细胞 胶质瘤 腺病毒 单克隆培养 胶质瘤细胞 耐药性 动物胶质 基因技术 基因消除 抗肿瘤靶 肿瘤耐药 转染细胞 连续PCR 基因 病毒液 冻存 扩增 敲除 研发 突变 损伤 细胞 研究 | ||
1.一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1、取动物胶质瘤肿瘤细胞冻存细胞进行单克隆培养，得胶质瘤肿瘤细胞悬液，备用；
A2、针对MDR1中的蛋白质编码序列，通过CRISPR在线设计工具分别设计针对于MDR1的sgRNA；所述MDR1的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
A3、将各sgRNA插入到腺病毒载体中，使其能表达，得重组腺病毒载体；
A4、将重组腺病毒载体转染至转染细胞中，直至出现明显细胞病变后，收集细胞，冻融释放病毒，在转染细胞中连续PCR扩增，获得大量病毒液，分层纯化病毒液，得高浓重组腺病毒载体；
A5、将高浓重组腺病毒载体加至胶质瘤肿瘤细胞悬液中，敲除胶质瘤肿瘤细胞的MDR1基因，得动物肿瘤模型。
2.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，其特征在于，步骤A3中，所述腺病毒载体含有绿色荧光标签蛋白。
3.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，其特征在于，针对于MDR1的各自所述sgRNA序列的设计选择在第一外显子。
4.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，其特征在于，所述腺病毒载体为Ad5F35腺病毒载体。
5.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，其特征在于，步骤A4的所述转染细胞为HEK293转染细胞。
6.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，其特征在于，所述PCR引物为：正向引物为5'-gcagggcgtgagcattagat-3'，反向引物为5'-gagttggcgacaaggacagaa-3'。
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