[发明专利]双基因修饰的骨髓间充质干细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术制药技术领域，具体涉及CX3CR1&IL‑25双基因修饰的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)及其制备方法和用途。高表达CX3CR1可以使MSC在体内定向迁移至炎症区域，提高MSC“归巢”效率，而不是随机散乱分布在体内各个部位；IL‑25作为一种抑炎因子，能够缓解炎症相关疾病，发挥免疫调节的能力。用这种双基因修饰的间充质干细胞治疗疾病将更有靶向性和有效性，将有效提高MSC的治疗效果。本发明所述的CX3CR1&IL‑25双基因修饰的骨髓间充质干细胞在制备炎症相关疾病的个性化治疗药物中具有广阔的应用前景。可制备成治疗炎症疾病和溃疡性结肠炎的药物。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及CX3CR1&IL-25双基因修饰的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)及其制备方法和用途。

背景技术

20世纪70年代，Friedenstein等人在骨髓中发现一种具有粘附特性、可分化的干细胞，将其称为骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)，该细胞能够分化成中胚层来源的组织，并在维持造血干细胞龛中发挥重要作用，体外培养时能够形成类似成纤维细胞的集落(Friedenstein A.,et al.,1974)。20世纪80年代，研究发现该细胞具有分化为软骨、成骨和脂肪的能力，遂将其命名为间充质干细胞。MSCs可从多种组织中分离获得，如：骨髓、脂肪组织、滑膜组织、肺组织、脐带血、外周血等。MSCs几乎存在于各个器官中，但由于种属差异以及不同组织微环境的作用，具有不同的表型标志，呈现异质性。国际细胞治疗大会制定了一系列标准定义人源性MSCs，即：1、体外培养时具有粘附可分化的特性；2、95％以上的细胞表面表达CD105、CD73和CD90分子标记，仅2％以下的细胞表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR(Penny J.,et al.,2012)。

近年来，对MSC的免疫调节作用的研究越来越深入。已证实MSCs主要通过分泌可溶性因子和细胞间接触的机制来调节免疫，抑制CD8⁺和CD4⁺T细胞、NK细胞的增殖和DC细胞的成熟，抑制B细胞的增殖及其向效应B细胞的分化，促进调节性T细胞(Treg)增殖(SingerN.,et al,2011)。由于MSC易于分离扩增，免疫原性低，具有旁分泌和免疫调节的功能，所以MSC在细胞治疗方面应用前景广阔。目前间质干细胞的临床试验有600多项(April 2015,clinicaltrials.gov)，适应症包括自身免疫病、骨/软骨疾病、移植排斥、心血管疾病、神经系统疾病等。申请人所在的课题组在前期工作中证实MSC在治疗软骨疾病中的作用及其免疫调节功能(Chen,J.,et al.,2011)。据报道，MSC还可用于治疗多发性硬化症(Li J.,etal.,2014)，糖尿病(Holmes,et al.,2014)等。

在临床试验中，MSC的治疗效果有时并不十分理想。有些研究者认为虽然MSC在体外有很好的免疫调节功能，例如能够有效抑制T细胞增殖等，但静脉输注的MSC并不能完全治疗小鼠慢性移植物抗宿主病(Sudres M.,et al.,2006)；另一些研究者称MSC在治疗肝脏损伤时，发现聚集在损伤部位的MSC数量少，这可能是由于MSC“归巢”效率过低，从而影响了治疗效果(Gao J.,et al.,2001)；还有研究者通过示踪发现MSC进入体内后散乱地分布在各个器官，例如肺、肝、骨髓等等(Paul Lin.,et al.,2013)，相当于MSC在体内“被稀释”，真正到达关键部位发挥作用的MSC数量并不可观，那么发挥的免疫调节功能也将大打折扣。所以，如何提高MSC“归巢”效率，减少在体内无序地分布，是MSC应用在临床治疗中面临的主要问题。