[发明专利]柑橘衰退病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种柑橘衰退病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒，包括总RNA提取试剂，引物CTV7、CTV6F和CTV6R，T7体外转录试剂盒，QX200 ddPCR EvaGreen supermix试剂盒。还公开了一种柑橘衰退病毒微滴数字PCR定量检测方法，包括如下步骤：(1)抽提总RNA；(2)用CTV7和CTV6R扩增总RNA，转录合成cRNA，用CTV6R对cRNA进行逆转录反应，获得cDNA；(3)以cDNA为模板，用CTV6F和CTV6R进行微滴数字ddPCR检测。本发明的ddPCR方法灵敏度高、特异性强，灵敏度比(RT‑)qPCR检测灵敏度高100倍。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种柑橘衰退病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒及方法。

背景技术

柑桔是世界第一大水果，柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的柑橘衰退病是世界柑桔生产中最严重的病害之一。CTV是属长线形病毒属(Closteroviridae)的正义单链RNA病毒，是目前已知病毒中基因组最大的病毒。CTV主要通过嫁接和蚜虫传播，发病迅速。30年代以来，柑橘衰退病已经造成了1亿株树的死亡。巴西作为世界柑桔产量第一的国家，曾一度因为柑桔衰退病的为害而使柑桔产业濒临崩溃。迄今为止，柑橘衰退病仍是世界柑桔产业的严重威胁。

准确、灵敏、快速的检测方法是柑橘病害防治、预测预报和建立无病毒苗木繁殖体系的前提和保障。目前，柑橘衰退病的检测方法主要有指示植物鉴定法、电子显微镜技术、血清学鉴定、(RT-)PCR、实时荧光定量(RT-)PCR[(RT-)qPCR]检测体系以及(RT-)LAMP。但指示植物鉴定法费时费力，显症率低。电子显微镜技术，血清学鉴定灵敏度较低。PCR产物易产生交叉污染且只能定性检测，qPCR需要依赖Cq值和标准曲线才能对起始模板进行相对定量分析。但由于不同样品之间的扩增效率是不同的，导致Cq值不是恒定不变的，同时qPCR在目的序列含量低、表达量差异十分微小、反应体系中含大量背景序列或抑制物等情况下，灵敏度和精确度都受到很大限制。因此微滴数字PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)应运而生。

ddPCR克服了qPCR技术的一些不足，能够把不同DNA模板分隔在不同的油包水小水滴中，有效避免反应过程中不同引物间、产物间的相互杂交和不同产物之间的竞争抑制，因此能够得到较好的扩增效率，也可实现不同模板的同时扩增，从而大大提高了检测的灵敏度和精确度。因此ddPCR是一种采用终点法判读、能够实现复杂来源样品中极低含量核酸分子稳定检出的无需标准曲线，也不需要内参的绝对定量技术。目前，ddPCR在医学临床诊断上的应用逐渐兴起，但在植物学研究、植物病害检验检疫方面的报道很少。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高的可以准确定量检测柑橘衰退病毒的微滴数字PCR检测试剂盒及方法。

本发明实现其目的采用的技术方案是：

一种柑橘衰退病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒，包括总RNA提取试剂，引物CTV7、CTV6F和CTV6R，T7体外转录试剂盒，QX200 ddPCR EvaGreen supermix试剂盒，所述CTV7、CTV6F和CTV6R引物序列为：

CTV7：5′-TAATACGACTCACTATAGGGTCCGACTCTGATAACGATG-3′，

CTV6F：5′-TCCGACTCTGATAACGATG-3′，

CTV6R：5′-ACCGCTAAACGATACAAC-3′。

一种柑橘衰退病毒微滴数字PCR定量检测方法，利用前述的检测试剂盒进行，包括如下步骤：

(1)取待测植株的叶片，抽提总RNA；