[发明专利]一种CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法。本发明通过在培养基中同时添加一定量的细胞因子IL‑2、IL‑7和IL‑21，并使培养过程中培养基中灭活自体血浆、细胞因子IL‑2、IL‑7和IL‑21保持在一定的浓度范围内，从而提升CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养效果，提高CD4+记忆性T淋巴细胞的纯度及功能性。本发明的扩增培养方法可很好的适用于CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养，能够诱导扩增出足够所需的细胞量，满足对该类T淋巴细胞体外扩增培养的需求，也因此采用本方法还可减少外周血的采集量。本发明方法成本相对较低，安全可靠，操作较为简单，便于推广使用。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法。

背景技术

人外周血中含有多种免疫细胞，其中淋巴细胞是人体主要的免疫细胞类型，包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等，目前临床研究及应用上进行的免疫细胞治疗以T细胞为主，如嵌合抗原受体技术(CAR-T)或T细胞受体(TCR-T)技术。自体来源的T细胞由于没有免疫原性可直接回输进行肿瘤等疾病的治疗，同时其具有的记忆性特征在一定程度上还可以抑制疾病的复发。过继性免疫细胞治疗是指将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞。过继性免疫细胞治疗是当前肿瘤免疫治疗中新兴的、具有显著疗效的一种治疗手段。其中，T细胞过继性免疫细胞治疗是现在国际上应用的最广泛、效果最显著的免疫治疗手段，其作用原理是利用体外扩增激活的特异性T细胞实施对抗原的杀伤功能。

特异性T细胞主要分为两种，CD4+T细胞和CD8+T细胞。在过继性免疫细胞治疗中，CD4+T细胞除了自身具有杀伤能力外，更可以辅助机体自身的免疫细胞以及共过继的免疫细胞，具有很强的泛用性，并能与CD8+T细胞相互补充。CD4+T淋巴细胞可以分为三个亚群，初始T淋巴细胞、效应性T淋巴细胞以及记忆性T淋巴细胞。

效应性T淋巴细胞细胞在体内存活寿命短，虽然有一定的清除效果，但无法达到长期治疗的效果，而记忆性T淋巴细胞则可以在体内维持自我更新，产生持久的杀伤效果，在免疫治疗中得到越来越多的重视。记忆性T淋巴细胞细胞在现在国际顶尖的免疫细胞治疗技术中常常作为基因工程的种子细胞进行修饰加工，增强其杀伤肿瘤细胞的能力。比如使用嵌合抗原受体技术(CAR-T)或T细胞受体(TCR-T)技术修饰记忆性T淋巴细胞，便可以获得杀伤性和持久性都很高的新型免疫细胞，进而应用于恶性肿瘤的治疗。

由于记忆性T淋巴细胞在人循环外周血中所占的比例较低，约占T淋巴细胞的2-4％，而即使采用流式细胞术进行分离，大约每250个PBMC细胞才能分离1个CD4+记忆性T淋巴细胞，而每500-1000个PBMC细胞才能分离1个CD8+记忆性T淋巴细胞细胞，因此，开发一种制作成本低，快速有效并且操作简单的分离和扩增CD4+记忆性T淋巴细胞已成为目前研究的重点。此外，现有的CD4+记忆性T细胞体外扩增培养方法面临的难题是在培养过程中CD4+T淋巴细胞会大量分化为CD4+效应性T淋巴细胞，因此扩增得到的细胞中CD4+记忆性T淋巴细胞的含量少，纯度低。

发明内容

本发明针对现有的CD4+记忆性T淋巴细胞体外扩增培养方法存在纯度较低，及CD4+T淋巴细胞容易分化为CD4+效应性T淋巴细胞的问题，提供一种可提高CD4+记忆性T淋巴细胞含量的CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，包括以下步骤：

(1)将CD4+T淋巴细胞加入至包被了CD3抗体和CD28抗体培养瓶中，用T淋巴细胞培养基重悬，并按培养瓶内液体总体积5％的量添加灭活自体血浆，然后将培养瓶置于37℃及CO₂体积浓度为5％的培养箱中培养24h。

优选的，在培养瓶内接种的CD4+T淋巴细胞的细胞密度为0.5×10⁶/mL。