[发明专利]一种高密度遗传连锁图谱的快速构建方法

权利要求书

1.一种高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：

A、栽培品种杂交授粉：始花期前将母本的雌花花序隔离，父本的花粉授到母本的雌花上继续隔离，待杂交果实成熟后收集杂交F1种子；

B、杂交F1种子处理与样品收集：杂交F1种子破壁后取种子子叶部分作为样品；

C、提取与纯化子叶中的微量DNA；

D、多重置换扩增方法处理子叶中的微量DNA，获得多个扩增后的DNA样品；

E、真假杂种鉴定：对扩增后的DNA样品进行PCR扩增，PCR扩增结果在遗传分析仪上鉴定其片段大小，最后对父、母本及杂交群体进行对比分析，若后代群体扩增出条带大小与父母本完全一致即为真杂种，扩增出其他片段大小的后代均为假杂种，直接剔除；

F、通过鉴定后的真杂种DNA进行测序，绘制高密度遗传连锁图谱。

2.根据权利要求1所述的高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，步骤A具体为：在母本雌花始花期前进行套袋隔离，套袋的花序总数量>100个；然后在雄花盛花期收集父本雄花的花粉，冷藏保存备用；待母本雌花盛花期时，进行人工点授，授粉后雌花再次密封隔离；待果实完熟后收集所有杂交果实，去除果肉，杂交F1种子阴干后冷藏保存。

3.根据权利要求2所述的高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，步骤A中待果实进入膨大期将纸袋拆掉换成纱网袋并挂牌标记。

4.根据权利要求2所述的高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，步骤B具体为：使用坚果破壳器将每粒种子的硬质外壳压碎后去除；然后使用手术刀和镊子在超净工作台上撕开核仁的外皮，同时只刮取>50mg的种子子叶部分样品置于离心管内，每份子叶样品均单独存放。

5.根据权利要求4所述的高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，步骤C具体为：C1、在每份装有子叶样品的离心管内加入一粒钢珠，用液氮浸泡后充分研磨；然后，直接加入CTAB提取液后混匀，金属浴后加入等体积抽提混合液，震荡混匀；

C2、离心，吸取上层水相于干净离心管中，加入等体积抽提混合液后震荡混匀，离心，再次吸取上层水相于干净离心管中；然后加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置，离心，去上清液，加入70％乙醇，震荡，离心，去上清液，吸取残留液体并晾干DNA沉淀，加入TE溶液溶解；

C3、使用微量DNA纯化试剂盒纯化上述DNA粗提液；具体操作步骤如下：DNA粗提液加0.5倍体积的Buffer P3和等体积无水乙醇，室温下充分混匀；混合液在离心条件下通过DNA吸附柱；弃去过滤液，将吸附柱放回原管，加入SPW后离心，弃过滤液后再次加入SPW清洗吸附柱；将吸附柱放回原管，离心以彻底去除各种残留液体；最后将吸附柱套入离心管中加入ddH₂O，离心洗脱吸附柱中DNA，重复洗脱1次；取2～5μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，置于-80℃冰箱保存备用，亲本直接采集少许嫩叶同步进行研磨及DNA提取。

6.根据权利要求5所述的高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，步骤D具体为：D1、样品加热变性及引物与质粒退火反应：ddH₂O 4.4μl，10×phi29DNA聚合酶缓冲液1.0μl，随机引物(100μM)2.5μl,引物序列为：NNNNNN，经硫代磷酸化修饰，DNA模板样品(1μg/ml)1.0μl，95℃加热3分钟，然后置于冰上15分钟；

D2、扩增反应：在上述反应液中加入dNTP(10mM)0.5μl，100X BSA 0.1μl，Phi29 DNA聚合酶(10U/μl)0.5μl，最终反应体系为：10.0μl，30℃温育过夜；

D3、热失活phi29DNA聚合酶：65℃，10分钟；

D4、经多重置换扩增后的DNA样品分别取2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测其质量及浓度。