[发明专利]一种哺乳动物卵母细胞去核的方法

说明书

本发明属于胚胎工程技术领域，具体涉及一种哺乳动物卵母细胞去核的方法。本发明方法包括以下步骤：获取卵丘卵母细胞复合体；去除卵丘卵母细胞复合体中卵母细胞透明带外围的卵丘颗粒细胞，剩下卵母细胞；将所得的卵母细胞孵育显核；将显核后的卵母细胞置于培养液中处理；调试荧光灯；将培养液处理后的卵母细胞清洗后转入去核液滴内；荧光下去核。本发明方法操作简便，极大地减少了胞质的损失量，确保了每个构建的克隆胚胎既损失很少的胞质又都是100％去核干净，提高了胚胎的发育潜力。

技术领域

本发明属于胚胎工程技术领域，具体涉及一种哺乳动物卵母细胞去核的方法。

背景技术

哺乳动物的体细胞核移植，即体细胞克隆是近代生物技术和生命科学领域的一项具有划时代意义的重大突破，该技术在家畜的遗传改良、生物反应器的制备、疾病动物模型、器官异种移植等领域都具有广阔的应用前景。在动物的细胞核移植操作中，第一步就是将卵母细胞内核物质的去除，去核是否完全是核移植成功的关键环节之一，去核不完全将导致其与供体核融合后产生的重构胚染色体套数异常，最终胚胎因发育受阻而流产或死亡。

目前哺乳动物体细胞核移植中普遍使用的去核方法是物理的机械去核法，即用显微操作的方法将经过特殊加工的毛细玻璃管插入到MII期的卵母细胞内，吸除核物质，得到去核卵。常用的机械去核方法主要有以下几种：

1.盲吸法：将卵母细胞固定在持卵针上，极体就会位于时钟4点的位置，去核针插入透明带内，吸去极体及其下部的1/5-1/4的胞质。用这一方法去核，因为没有确切的看到核物质，必然会有一部分卵的核没有去掉或没有完全去掉，因为第一极体在卵周隙中是可以自由游动的，而且随着极体排出时间的延长，其与染色体的相对位置会发生很大变化，因而以第一极体作参照，估计染色体的位置来去核，准确性不高。

2.Hochest33342染色法：Hochest33342是一种DNA活性荧光染料，可与DNA特异结合，经紫外光激发后发蓝色荧光，因此卵母细胞经Hochest33342染色后在紫外光显微镜下可被准确去核。但是紫外光照射卵母细胞如果超过15秒，就会对卵胞质产生损伤，特别是对线粒体地伤害尤为严重，从而影响重构胚的后期发育。

3.Spindle-view系统去核法：偏振光显微镜(spindle-view)是采用电子光学硬件和计算机数据处理程序，利用有序高分子对偏振光的折射现象来观察细胞内的高分子结构。卵母细胞内减数分裂纺锤体是高分子物质如微丝微管、肌动蛋白细丝环等物质有序排列而成。这些物质均可以使偏振光发生折射，因此偏振光通过卵母细胞减数分裂纺锤体时发生折射，这种折射可以被检偏器捕捉，并通过偏振光显微镜观察。与牛、羊等家畜和小鼠、家兔等实验动物的卵子细胞质较为清亮，纺锤体易于观察相比，由于猪的卵母细胞中颗粒性物质(如脂肪微滴等阻光物质)较多，对纺锤体观察影响较大。该装置价值昂贵，应用范围有限，不利于大量推广。

目前，中国文献数据库2006年公开《卵母细胞去核及卵丘细胞移核方法对猪体细胞核移植的影响》，其中1.4.3节公开了：盲吸法和活性荧光染色法联合去核法，将体外成熟的卵母细胞在含Hoechst33342(5μg/mL)和细胞松弛素B(5μg/mL)的显微操作液中染色处理10-15min，先通过盲吸法去核，然后将此去核针移入另外一个远离卵母细胞含有荧光染料的液滴中用紫外光照射，若发现针内含有大量的蓝色荧光物质，则认为去核操作成功；若未发现或只发现少量的蓝色荧光，则认为未能去核或去核不完全，应借助紫外光照射对原卵母细胞重新定位去核，该方法的盲吸和荧光检测是分布进行的。该方法存在的缺点为先盲吸后荧光染色检测去核效率，无法改变盲吸法去核对胞质的过多吸取，胞质的过多损耗会影响胚胎的发育潜力，该方法每操作一个卵母细胞都要移到别的液滴进行荧光染色检测，而且还有去核不干净的需要重新定位去核，造成了操作时间的延长，不利于规模化操作。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种卵母细胞去核的改进方法，操作简便，极大地减少了胞质的损失量，确保了每个构建的克隆胚胎既损失很少的胞质又都是100％去核干净，提高了胚胎的发育潜力。