[发明专利]一种iCAR-T细胞的制备方法

说明书

本发明涉及基因领域，特别涉及一种iCAR‑T细胞的制备方法。一种iCAR‑T细胞的制备方法，CAR‑T的DNA序列插入到iPS细胞的AAVS1位点，得到的CAR‑iPS细胞分化获得iCAR‑T细胞。本发明制备的iCAR‑T细胞由CAR‑iPS分化获得，iPS细胞可增殖周期长，更便于进行基因修饰。相对于慢病毒感染获得的iCAR‑T细胞，CAR‑iPS分化获得的iCAR‑T纯度更高，可以接近于100％；基因插入位点均为AAVS1位点，插入位置明确，安全性更高；由于iPS可近乎无限增殖，因此由CAR‑iPS获得的iCAR‑T也可近乎无限获得，不受外周血分离影响。

技术领域

本发明涉及iCAR-T细胞制备领域，具体而言，涉及一种iCAR-T细胞的制备方法。

背景技术

目前，CAR-T的制备主要是通过慢病毒感染对原代T细胞进行基因修饰。

如申请号为201610744414.4涉及免疫学和分子生物学领域，特别涉及一种制备CAR-T细胞的方法以及制得的CAR-T细胞及其应用。一种制备CAR-T细胞的方法，是将包含CAR的病毒感染CD3阳性T细胞得到CAR-T细胞。

如申请号为201711479751.6公开了一种CAR-T细胞的制备方法、制得的CAR-T细胞及其应用，所述制备方法包括以下步骤：S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增：将分离的CD3+CD8+T淋巴细胞激活后培养扩增；S2、携带CAR的重组慢病毒感染所述步骤S1处理后的T淋巴细胞，制得所述CAR-T细胞，其中，所述携带CAR的重组慢病毒中携带的CAR基因包含CD28胞内区和4 1BB胞内区，所述CD28胞内区和4 1BB胞内区的核苷酸序列分别如SEQ ID7和SEQID9所示。本发明制备方法制得的CAR-T细胞可广泛应用于多种癌症的治疗。与现有技术相比，本发明方法制备的CAR-T细胞增殖率相比于常规方法得到了显著提高。

如申请号为201710730561.0公开了一种CAR-T细胞的制备方法，用于全封闭的CAR-T细胞制备设备，其包括：1)将血液样本和等体积的淋巴细胞分离液加入分离培养罐中进行离心分离以获得单个核细胞；2)对上述单个核细胞进行分选以获得T细胞；3)在分离培养罐中对T细胞进行诱导培养；4)将带有目的基因的载体和经过诱导培养的T细胞按照预设比例混合后进行基因转导；5)于分离培养罐内对经基因转导的细胞进行扩增培养；6)获得CAR-T细胞终产品，进行包装。上述CAR-T细胞的制备方法中，利用分离培养罐制备CAR-T细胞，相比于现有技术中利用培养皿体外培养CAR-T细胞的方式，其步骤规范，更便于实现CAR-T细胞的大规模生产。

还有针对不同疾病制备的CAR-T细胞，如申请号为201710672564.3公开了一种针对小细胞肺癌的CAR-T细胞制备方法，该方法包括如下步骤：采集患者外周血并加入至Ficoll淋巴细胞分离液中；吸取离心液中两液面交界处的细胞层至离心管中，加入生理盐水洗涤，离心得到T细胞；T细胞体外扩增；将慢病毒对S4中的T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-T细胞；将CAR-T细胞与人血白蛋白，并加入生理盐水，制备成小细胞肺癌细胞制剂。

由于慢病毒感染，修饰基因插入位点不明确，感染效率受限，且有潜在的致瘤风险。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种iCAR-T细胞的制备方法，涉及CRISPR/Cas9介导的基因修饰技术以及iPS细胞向T细胞定向分化技术，iCAR-T细胞由CAR-iPS分化获得。相对于慢病毒感染获得的CAR-T细胞，CAR-iPS分化获得的iCAR-T纯度更高，可以接近于100％；iPS诱导的T细胞，来源于同一株单克隆，DNA遗传信息均一稳定；基因插入位点均为AAVS1位点，插入位置明确，安全性更高；由于iPS可近乎无限增殖，因此，由CAR-iPS获得的iCAR-T细胞也可近乎无限获得，不受外周血分离影响。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：