[发明专利]一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法

说明书

本发明涉及一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，利用交叠PCR技术获得了上下游同源臂的融合片段，采用混合孵育的方式完成了重组质粒的转化，并利用二次同源重组技术有效敲除了鳗弧菌的鞭毛蛋白FlaB。本发明简单易行，极大的提高了基因敲除的效率，为鳗弧菌的基因敲除提供了技术支持，同时也为鞭毛蛋白的生物学功能研究提供新的思路。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，特别涉及一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法。

背景技术

鳗弧菌属于革兰氏阴性菌，其广泛的存在于我国沿海水体和淤泥中，并且经常粘附在海洋生物的体表和肠道中，是水产养殖中常见的一类致病菌，能引起鱼类肠道粘膜脱落、肝脏坏死、体表溃烂、鳃丝出血、粘液增多等症状。有研究报道指出，我国海水养殖大黄鱼、鲈鱼、牙鲆、大菱鲆等海水鱼类受鳗弧菌感染严重，且经常导致虾类黄鳃病的发生，所以其危害性非常大。因为鳗弧菌病具有死亡率高、感染范围广、传播速度快等特点，因此经常给我国的海水养殖产业带来巨大的经济损失。

鞭毛是细菌体表重要的细胞器和附属结构，呈弯曲波浪状形态，是细菌独有的运动器官。最初，鞭毛被简单的认为仅仅是细菌的运动器官，但是随着对鞭毛结构和功能研究的不断深入，人们发现鞭毛的运动性可以帮助细菌侵入宿主细胞，并且鞭毛介导的粘附在致病菌定值易感鱼群的过程中起着关键性作用。除此之外，鞭毛也是鱼类宿主先天性免疫应答的诱导剂，能够诱发严重的免疫反应，所以鞭毛在细菌的致病过程亦发挥着重要作用，可以通过与寄主细胞上的免疫受体结合而诱发炎症。研究发现，鳗弧菌具有非常典型的鞭毛结构，而且其鞭毛合成系统非常完整。所以敲除鳗弧菌的鞭毛蛋白可以有效、深入的探索鞭毛蛋白在鳗弧菌运动和免疫中的作用。

细菌的基因敲除是遗传工程技术的一种，主要针对某个已知序列但功能未知的序列，通过改变或删除相关的遗传基因，使得基因功能丧失作用，从而检测分析该基因的生物学功能。然而，目前细菌基因敲除的方法较多，很难形成统一、有效的技术；再加上细菌的种类繁多，其形态特征、内部结构和生理特性具有较大的差异，所以细菌基因敲除技术的难度较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，该方法简单易行，极大的提高了基因敲除的效率。

本发明提供了一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，包括：

(1)采用交叠PCR技术获得鞭毛蛋白FlaB上下游同源臂的融合片段；(利用PCR技术在菌体外进行有效的基因重组，不需要内切酶和连接酶进行剪接)

(2)利用重组酶Exnase II将融合片段与自杀载体pLP12进行重组，构建重组自杀质粒pLP12-FlaB；

(3)以大肠杆菌β2163作为重组自杀质粒的供体菌，以鳗弧菌作为受体菌，采用混合孵育完成重组自杀质粒pLP12-FlaB的转化；

(4)运用二次同源重组技术敲除鳗弧菌的FlaB基因，即可。

所述步骤(1)中的上游同源臂扩增引物的碱基序列如下：

FlaB-MF1：GGAATCTAGACCTTGAGTCGAAGAATCGGTTGCCATTGTTGA；

FlaB-MR1：GATGGTGACTGCTTCGCCTGCATTGCAGACACGTTAGTGCTTACA；

下游同源臂扩增引物的碱基序列如下：

FlaB-MF2：TGTAAGCACTAACGTGTCTGCAATGCAGGCGAAGCAGTCACCATC；

FlaB-MR2：ACAGCTAGCGACGATATGTCCACCTTAGCAACCAATAAACCTGTA。

所述步骤(2)中的重组的工艺条件为温度37℃，时间30min。