[发明专利]一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法有效
| 申请号： | 201811210295.X | 申请日： | 2018-10-17 |
| 公开（公告）号： | CN109517844B | 公开（公告）日： | 2021-04-30 |
| 发明（设计）人： | 高权新;彭士明;闵明华;岳彦峰 | 申请（专利权）人： | 中国水产科学研究院东海水产研究所;湖州师范学院生命科学学院 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N1/21;C12R1/63 |
| 代理公司： | 上海泰能知识产权代理事务所(普通合伙) 31233 | 代理人： | 黄志达;魏峯 |
| 地址： | 200090 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 弧菌 鞭毛 蛋白 基因 方法 | ||
1.一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，包括：
(1)采用交叠PCR技术获得鞭毛蛋白FlaB上下游同源臂的融合片段；
(2)利用重组酶Exnase II将融合片段与自杀载体pLP12进行重组，构建重组自杀质粒pLP12-FlaB；
(3)以大肠杆菌β2163作为重组自杀质粒的供体菌，以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)作为受体菌，采用混合孵育完成重组自杀质粒pLP12-FlaB的转化；
(4)运用二次同源重组技术敲除鳗弧菌的FlaB基因，即可。
2.根据权利要求1所述的一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的上游同源臂扩增引物的碱基序列如下：
FlaB-MF1：GGAATCTAGACCTTGAGTCGAAGAATCGGTTGCCATTGTTGA；
FlaB-MR1：GATGGTGACTGCTTCGCCTGCATTGCAGACACGTTAGTGCTTACA；
下游同源臂扩增引物的碱基序列如下：
FlaB-MF2：TGTAAGCACTAACGTGTCTGCAATGCAGGCGAAGCAGTCACCATC；
FlaB-MR2：ACAGCTAGCGACGATATGTCCACCTTAGCAACCAATAAACCTGTA。
3.根据权利要求1所述的一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的重组的工艺条件为温度37℃，时间30min。
4.根据权利要求1所述的一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用引物扩增筛选阳性克隆，引物序列如下：
FlaB-TF：TACAAGTCTTCGCTGGCAGTAATAA；
FlaB-TR：GGCCAAGCTCATTATCAATACGTT。
5.根据权利要求1所述的一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(4)第一次同源重组使用20μg/mL氯霉素和0.3％D-Glucose筛选；第二次同源重组使用0.4％L-阿拉伯糖筛选。
6.根据权利要求1所述的一种鳗弧菌鞭毛蛋白基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(4)最后对所得敲除菌株进行筛选、鉴定时的引物序列如下：
pLP-UF：GACACAGTTGTAACTGGTCCA；
pLP-UR：CAGGAACACTTAACGGCTGAC。
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