[发明专利]一种用于肾病检测的试剂盒、及其制备和使用方法

说明书

本发明提供一种用于肾病检测的试剂盒、及其制备和使用方法，该试剂盒，包括：蛋白包被板、酶标液、显色液、洗涤液、样本稀释液、终止液、阴性对照品、阳性对照品、以及至少两个与不同梯度对应的阳性校准品；其中，所述蛋白包被板设有磷脂酶A2受体蛋白。本发明提供的用于肾病检测的试剂盒、及其制备和使用方法，具有无创伤、低风险、操作方便、灵敏度高的特点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于肾病检测的试剂盒、及其制备和使用方法。

背景技术

膜性肾病(Membranous Nephropathy，MN)是成人肾病综合征(NephroticSyndrome，NS)最常见的病理类型，为我国原发性肾小球疾病的第二大病因，其中70％膜性肾病患者表现为持续反复的蛋白尿，从而导致肾脏损伤，甚至危及生命。膜性肾病可分为特发性膜性肾病(Idiopathic Membranous Nephropathy，IMN)和继发性膜性肾病(SecondaryMembranous Nephropathy，SMN)，其中IMN患者约占70％～80％，SMN患者约占20％～30％。其中75％～85％的IMN患者有肾病程度的蛋白尿，约40％～60％的IMN患者会在5～20年内发展为终末期肾衰竭。传统的IMN临床诊断方法为肾脏穿刺进行肾组织病理学检查，包括光镜、荧光和电镜，这是一种侵入式的检测方法，不仅需要有较高的技术要求，还对患者有一定的损伤。

目前已经证实PLA2R受体，即磷脂酶A2受体，是自身抗体的主要靶抗原，研究发现75％的IMN患者血清中抗PLA2R受体抗体为阳性，而在继发性膜性肾病患者极少表现为阳性，其他类型肾小球疾病患者、健康人群均为阴性。因此，临床中迫切需要研制一种无创伤、低风险、操作方便、灵敏度高的PLA2R定量检测方法。

发明内容

本发明提供一种用于肾病检测的试剂盒、及其制备和使用方法，以解决PLA2R自身抗体定量检测的问题。

根据本发明第一方面，提供一种用于肾病检测的试剂盒，包括：蛋白包被板、酶标液、显色液、洗涤液、样本稀释液、终止液、阴性对照品、阳性对照品、以及至少两个与不同梯度对应的阳性校准品；

其中，所述蛋白包被板设有磷脂酶A2受体蛋白。

进一步，本发明所述的试剂盒，

所述样本稀释液采用无蛋白封闭液；

所述洗涤液采用磷酸盐吐温缓冲液；

所述显色液采用四甲基联苯胺溶液；

所述终止液采用浓度为0.25％至0.35％的硫酸溶液。

进一步，本发明所述的试剂盒，所述磷脂酶A2受体蛋白通过如下步骤制备得到：

根据PLA2R胞外片段基因设计PCR引物，并且进行PCR扩增处理；

将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体，以得到连接产物；

对所述连接产物进行基因测序以验证克隆结果，并选取基因测序正确的所述连接产物；

利用所述连接产物进行转染处理，以得到转染细胞；

对所述转染细胞进行压力筛选处理；

对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞；

对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理；

对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞；

对所述转染细胞进行工程细胞大规模表达；

利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白，并进行纯化处理。