[发明专利]一种用于肾病检测的试剂盒、及其制备和使用方法

权利要求书

1.一种用于肾病检测的试剂盒，其特征在于，包括：蛋白包被板、酶标液、显色液、洗涤液、样本稀释液、终止液、阴性对照品、阳性对照品、以及至少两个与不同梯度对应的阳性校准品；

其中，所述蛋白包被板设有磷脂酶A2受体蛋白。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，

所述样本稀释液采用无蛋白封闭液；

所述洗涤液采用磷酸盐吐温缓冲液；

所述显色液采用四甲基联苯胺溶液；

所述终止液采用浓度为0.25％至0.35％的硫酸溶液。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述磷脂酶A2受体蛋白通过如下步骤制备得到：

根据PLA2R胞外片段基因设计PCR引物，并且进行PCR扩增处理；

将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体，以得到连接产物；

对所述连接产物进行基因测序以验证克隆结果，并选取基因测序正确的所述连接产物；

利用所述连接产物进行转染处理，以得到转染细胞；

对所述转染细胞进行压力筛选处理；

对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞；

对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理；

对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞；

对所述转染细胞进行工程细胞大规模表达；

利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白，并进行纯化处理。

4.一种用于肾病检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：

使用包被缓冲液将磷脂酶A2受体蛋白稀释；

将稀释后的磷脂酶A2受体蛋白加入96孔板进行包被；

将包被磷脂酶A2受体蛋白的96孔板使用无蛋白封闭液进行封闭；

洗涤封闭后的96孔板并拍干；

将拍干后的96孔板密封包装，以得到蛋白包被板；其中，所述蛋白包被板包含所述磷脂酶A2受体蛋白。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括：制备阳性校准品；

所述制备阳性校准品的步骤包括：

使用蛋白稳定剂稀释阳性血清标本，以得到原始阳性标准品；

对所述原始阳性标准品进行梯度稀释，得到与每个梯度相对应的所述阳性标准品。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括：

根据至少两个与不同梯度对应的所述阳性标准品绘制校准曲线。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括：制备酶标液；

所述制备酶标液的步骤包括：

按照1:4900至1:5100的工作浓度稀释酶结合物；其中，所述酶结合物采用兔抗人或鼠抗人的免疫球蛋白偶联的辣根过氧化物酶。

8.根据权利要求4至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括：

制备阴性对照品和阳性对照品；

其中，所述阴性对照品采用健康人标本血清制备，所述阳性对照品采用患者临床标本血清制备。

9.一种用于肾病检测的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法适用于权利要求1至3中任一项所述的试剂盒；

所述使用方法包括：

使用样本稀释液稀释待测样本；

将稀释后的所述待测样本加入蛋白包被板，并且将阴性对照品、阳性对照品、以及至少两个与不同梯度对应的阳性校准品分别加入所述蛋白包被板；其中，所述蛋白包被板包含磷脂酶A2受体蛋白；

使用洗涤液洗涤所述蛋白包被板并拍干；

在所述蛋白包被板加入酶标液；

使用所述洗涤液洗涤所述蛋白包被板并拍干；

使用显色液对所述蛋白包被板进行显色反应；

使用终止液对所述蛋白包被板终止反应；

读取所述蛋白包被板中每孔的OD值，并根据所述阳性标准品的OD值和校准曲线计算所述待业样本的磷脂酶A2受体蛋白抗体的浓度。