[发明专利]半滑舌鳎性别标签piR-mmu-29271668的应用

说明书

一种半滑舌鳎性别标签piR‑mmu‑29271668的应用，所述性别标签piR‑mmu‑29271668来源于鱼精浆外泌体，本发明通过small RNA测序分析，筛选到两种鱼显著差异表达的标签piRNAs作为候选，通过实时定量PCR验证，最终确定了对两种鱼具有指示作用的piRNA生物标志物，标签piRNAs为piR‑mmu‑29271668，序列为GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTTTGGA，并以此为基础开发制备了检测试剂盒。本发明方法具有无创，高效的优点，且鉴定结果可靠，是首次通过定量检测来判别半滑舌鳎的遗传性别。

技术领域

本发明属于鱼类生物技术领域，特别是涉及一种半滑舌鳎性别标签piR-mmu-29271668的应用。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)由于雌、雄鱼生长速度和体型的巨大差异，以及养殖中雄鱼比例高，经济价值低的问题，产业发展受到一定程度的制约。研究发现雄鱼中有很大比例的伪雄鱼，即遗传上是雌鱼，但表型上是雄鱼。而用伪雄鱼作为父本，后代也会遗传父亲的特征成为伪雄鱼，导致了雄鱼比例高的问题。因此鉴别伪雄鱼对于半滑舌鳎育种产业具有重要的意义。传统的雌性特异微卫星分子标记法需要琼脂糖电泳条带识别，具有一定的误差；而染色体鉴定准确性受制片效果的制约，这两种方法都是定性的判断。本发明开发了半滑舌鳎精浆外泌体piRNAs标志物，应用定量PCR的方法定量考察piRNA的表达量以实现鉴别半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼，具有准确性高、结果稳定可靠的优势。

主要存在于动物生殖系统的piRNA(Piwi-interactiing RNA)是一类长度约为26-32nt(nucleotides)的非编码RNA。piRNA在动物发育和生殖调控中起重要作用,在果蝇卵巢生殖细胞中,经PIWI家族蛋白的协同、加工,piRNA经过乒乓循环(“Ping-Pong”cycle)在细胞中的大量扩增,其具体作用机制还有待发掘。在海洋动物中外泌体来源的piRNAs作为生物标志物的研究几乎没有报道，本发明开发了的一种半滑舌鳎精浆外泌体piRNAs标志物，解决了半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼遗传性别的识别问题，具有创新性。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种半滑舌鳎性别标签piR-mmu-29271668的应用，所述的性别标签piR-mmu-29271668来源于半滑舌鳎的精浆外泌体piRNA，以解决半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼遗传性别的区分问题。在海洋动物中外泌体来源的piRNA作为生物标志物的研究几乎没有报道，本发明开发了针对以半滑舌鳎为代表的鱼精浆来源的外泌体提取及初步应用的方法，解决了半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼遗传性别的识别问题。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种半滑舌鳎性别标签piR-mmu-29271668的应用，所述的性别标签piR-mmu-29271668来源于半滑舌鳎的精浆外泌体piRNA，序列为GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTTTGGA。

本发明还提供一种所述精浆外泌体piR-mmu-29271668的筛选方法，具体步骤如下：

1)精浆外泌体分离鉴定后，对精浆外泌体smallRNA进行测序分析，Small RNA种类繁多，将clean reads依次和Rfam数据库、cDNA序列、物种重复序列库、piRBase数据库进行比对，以对测序结果中的smallRNA进行分类注释；将注释后的序列和piRBase数据库比对，进行已知piRNA的统计；使用未注释上的序列进行新的piRNA预测，piRNA差异表达分析，差异表达piRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后与雄鱼、伪雄鱼样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种对雄鱼和伪雄鱼两种样品具有指示作用的piRNA作为候选的生物标记物；