[发明专利]一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法

说明书

本发明属于干细胞领域，公开了一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法，取皮肤组织预处理后，加Dispase II分散酶消化，清洗后反复吹打组织块使其细胞分离，过滤后离心，得到细胞沉淀用Lonza完全培养基重悬后接种于培养皿中培养60‑90min；取未贴壁的细胞悬液接种至纤黏连蛋白包被的培养板中培养，待细胞汇合达到80％～90％后进行传代。利用本发明所述原代分离方法分离培养的皮肤间充质干细胞细胞膜不会受到伤害，细胞培养稳定，且不会引入支原体污染，可分离出大量皮肤间充质干细胞，且细胞活力好，能够后续稳定培养。

技术领域

本发明属于干细胞领域，具体涉及一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为胚胎干细胞，多能干细胞以及各种组织中的定向干细胞如造血干细胞、神经干细胞等。目前，已有利用干细胞治疗心肌梗塞、红斑狼疮、类风湿性关节炎、神经损伤、肌肉萎缩等的实验报道。人体干细胞是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种超能干细胞群，在特定环境下可诱导分化成多种组织细胞。在人体干细胞中，间充质干细胞广泛存在于全身各种组织中，特别是骨髓、脂肪脐带、皮肤和胎盘。而现有的间充质干细胞的研究主要侧重于从骨髓和脐带中获得，对于皮肤间充质干细胞的研究却很少。由于皮肤是人体中体积最大的组织器官，且取材方便，所以选择皮肤间充质干细胞作为细胞治疗的种子细胞具有广阔前景。

皮肤干细胞在维持皮肤与粘膜的正常组织结构和细胞内环境稳定中起重要作用。在遗传性皮肤病的基因治疗和受损伤皮肤和粘膜功能与结构的重建方面，皮肤干细胞有着极其重要的作用。皮肤干细胞由其自身特性，具有着广泛的应用前景，例如：组织工程皮肤构建、在创伤修复中的应用、在基因研究及遗传性疾病的治疗、细胞谱系的研究等等。

现有技术中皮肤间充质干细胞的分离方法是用含EDTA的胰蛋白酶来消化皮肤组织，经过滤后接种于特定培养基中。胰蛋白酶属于蛋白水解酶类，应用此方法分散组织、分离细胞会使细胞膜严重受损，在细胞培养时不稳定，甚至引入支原体污染。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效、经济、稳定、便捷的皮肤间充质干细胞的原代分离方法，以便分离出大量皮肤间充质干细胞，并能够后续稳定培养。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法，包括如下步骤：

A、取皮肤组织预处理后加Dispase II分散酶消化，清洗后反复吹打组织块使其细胞分离，过滤后离心，得到细胞沉淀用Lonza完全培养基重悬后接种于培养皿中培养；

B、取未贴壁的细胞悬液接种至纤黏连蛋白包被的培养板中培养，待细胞汇合达到80％～90％后进行传代。

本发明所述分离方法首先对皮肤组织进行预处理。

其中，所述预处理为皮肤组织剪成3-5mm长方形，用氯化钠注射液清洗后置于75％乙醇中清洗，再用氯化钠注射液清洗后剪成细小组织块。

在一些实施方案中，针对新鲜采集的皮肤组织，还需要用含双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液4℃保存用于后续的预处理。其中双抗为青链霉素混合液。青霉素-链霉素溶液(100×)中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。在本发明所述生理盐水及葡萄糖溶液中双抗的浓度优选为1×，即青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。

本发明所述分离方法采用Dispase II分散酶对皮肤组织进行消化。Dispase II分散酶，即中性蛋白酶，是一种非特异性的金属蛋白酶，该酶不会伤害细胞膜，且因为其来源于细菌，故不会引入支原体或任何动物病毒；温度、PH、血清成份等的差异对Dispase II分散酶的影响很小，该酶经稀释后活性大大降低，方便了后续的细胞培养。