[发明专利]一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法

说明书

本发明提供了一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法，属于生物发酵技术领域。本发明提供的方法先在36～38℃条件下发酵培养菌株至OD₆₀₀＝25～30，得到待诱导发酵液；然后将所述待诱导发酵液分阶段降温和添加诱导剂，结合溶氧水平的变化观察菌体适应情况，待溶氧量稳定后，得到最终诱导发酵液，维持发酵状态至发酵结束。按本发明提供的方法对菌体进行诱导，能最大限度地降低诱导剂对菌体的毒害，有效解决菌体对低温和诱导剂的适应性差的问题。发酵结束后菌体OD₆₀₀不低于100，菌体湿重达到180g/L以上，发酵液中酪氨酸酚裂解酶的表达量大于15g/L。

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法。

背景技术

左旋多巴又名3,4-二羟基苯丙氨酸，为白色结晶性粉末，无臭无味，在乙醇、氯仿和丙酮中不溶，在稀酸中易溶。作为一种重要的生物活性物质，左旋多巴是神经递质多巴胺的前体，可以通过血脑屏障，进入脑循环而到达中枢神经系统，在中枢神经脱羧酶的作用下，转化为多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加以达到治疗帕金森疾病的作用。左旋多巴是治疗老年帕金森病的首选和最有效药物，除此之外，左旋多巴还具有治疗弱视和心力衰竭的作用，虽然长时间的使用以后会有一些副作用，但目前并没有更好的替代药物出现。

目前市面上的药物或者是植物提取，或者是化学合成，但是均无法保证原料来源，产量远远满足不了市场需求。随着分子生物学及生物技术的迅速发展，利用生物合成左旋多巴已经成为一种很有竞争力、前途光明的方法。生物合成法是通过酪氨酸酚裂解酶催化邻苯二酚、丙酮酸钠和氨水生成左旋多巴。左旋多巴的生产水平受酪氨酸酚裂解酶的影响，所以提高左旋多巴生产量的重点在于提高酪氨酸酚裂解酶的表达量(酶活性)。

在现有的酪氨酸酚裂解酶发酵过程中，常规采取一步降温法结合一次性加入诱导剂的方法提高表达量。比如当发酵过程进行到一定程度时(通常以OD₆₀₀为指标)，将发酵温度(E.coli通常为37℃)降低到某一温度(比如25℃)，然后加入一定量的诱导剂(通常为IPTG)，保持温度直至发酵结束，最后检测发酵最终的OD₆₀₀、菌体湿重和表达量。这种方法虽然能在一定程度上提高酪氨酸酚裂解酶的表达量，但由于诱导剂对菌体存在一定毒害作用，所以会导致一定量的菌体死亡；未死亡的菌体代谢活性较低，表现在发酵OD₆₀₀增长缓慢，菌体湿重较低，酪氨酸酚裂解酶的表达量较低。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于解决菌体对低温和诱导剂适应性差的问题，提高酪氨酸酚裂解酶的表达量。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法，包括如下步骤：

(1)在36～38℃条件下发酵培养菌株至OD₆₀₀＝25～30，得到待诱导发酵液；

(2)将所述待诱导发酵液降温至31～33℃，待溶氧量稳定至25～35％，得到初步诱导发酵液；

(3)将所述初步诱导发酵液降温至25～27℃，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.065～0.085mmol/L，待溶氧量稳定至25～35％，得到二次诱导发酵液；

(4)将所述二次诱导发酵液降温至19～21℃，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.14～0.16mmol/L，待溶氧量稳定至25～35％，得到最终诱导发酵液，维持发酵状态至菌株的OD₆₀₀不增加结束发酵。

优选的，所述步骤(1)中菌株为高效表达酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌基因工程菌。