[发明专利]一种调控番茄腺毛形成的基因及克隆方法

权利要求书

1.一种调控番茄腺毛形成的基因，其特征在于，所述调控番茄腺毛形成的基因lncRNA全长cDNA序列为1266bp；cDNA序列为SEQ ID NO：1。

2.一种如权要求1所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，其特征在于，所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，包括：

步骤一：采用paired-end ssRNA-Seq，测定I型腺体毛、Wo基因突变体和野生型对照Ailsa Craig的转录组数据；

步骤二：利用TopHat2与参考基因组进行比对，再结合Cufflinks进行转录本的拼接，获得转录本；

步骤三：通过去除表达量和可信度低的单外显子转录本、选择转录本长度200bp的转录本、筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本、选择FPKM≥0.5的转录本，确定疑似lncRNAs；

步骤四：利用两种编码潜能分析软件PFAM和CPC，对疑似转录本分别进行编码潜能的预测，取交集，最终获得lncRNAs。

3.如权利要求2所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，其特征在于，调控番茄腺毛形成的基因为：lncRNA000100；

所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，进一步包括：

RNA-seq分别获得109,747,652、102,356,032、104,576,556、99,279,862、102,811,164、105,689,184原始数据；去除低质量的原始数据，分别获得高质量的reads数107276494、100109508、102147322、96925110、100477710和103228014；

利用TopHat2与参考基因组进行比对的结果，再结合Cufflinks进行转录本的拼接，共获得70965个转录本；

对70965个转录本进行进一步分析，通过去除表达量和可信度低的单外显子转录本、选择转录本长度200bp的转录本、筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本、选择FPKM≥0.5的转录本步骤，确定2356个转录本为疑似lncRNAs；

分别利用两种主流的编码潜能分析软件PFAM和CPC对2356个转录本分别进行编码潜能的预测，取交集，最终共获得1303个lncRNAs。

4.一种如权利要求1所述调控番茄腺毛形成的基因在番茄遗传改良中的应用，其特征在于，所述应用包括：

提取番茄叶片基因组RNA，利用反转录酶试剂盒将RNA反转录成cDNA；通过PCR扩增得到lncRNA000100产物，经1％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒回收目的片段，用pEasy-Blunt载体克隆，取5μL连接产物进行热击处理；转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素/异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖苷(Amp/IPTG/X-gal)的LB固体平板上，37℃培养过夜，挑选蓝斑1个和白斑若干，于含Amp 100mg/L的液体LB培养基中，于37℃200r/min振荡培养过夜，用小量法提取质粒；

将所述质粒用lncRNA000100特异引物进行检测，对经检测正确的阳性重组克隆进行序列测定。