[发明专利]通过多条sgRNA共注射实现同一基因有效敲除

说明书

通过多条sgRNA共注射实现同一基因有效敲除。敲除方法包括：选定待敲除基因的编码区的至少两个目标序列，使其分别包含完整的目标密码子CAA、CAG或CGA；利用至少两个sgRNA序列来将BE3定位到相应的目标序列以使目标密码子中的目标单碱基C变成T从而相应引入终止密码子TAA或TAG、TGA以实现基因敲除；所述至少两个sgRNA序列为分别与所述至少两个目标序列互补对应的序列，其中所述至少两个sgRNA被共注射以实现同一基因的有效敲除。本发明提供了一种更高效，且具有高精确性和低脱靶效应的基因敲除方法。

技术领域

本发明涉及基于碱基编辑的基因敲除方法策略的改进及其应用。

背景技术

基因编辑技术指对目标基因进行“编辑”，将期望的变化引入基因组DNA的靶位点的过程。早期的基因编辑是通过发现内源性同源重组来实现的。然而，传统的真核生物靶向基因操作具有基因打靶效率低，应用范围有限等缺点。II型CRISPR/Cas9(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated Cas9 endonuclease)系统的发现与应用打破了原有限制，该系统被证明是一种多用途基因编辑的工具[Le etal.,2013；Patrick et al.,2014]。

CRISPR/Cas9系统介导特异性基因敲除(knockout)是利用sgRNA(single guidedRNA)通过靶序列互补引导Cas9蛋白定位剪切双链DNA，发生非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)修复，造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除，该方法在实际应用上主要有以下缺点：首先非同源性末端接合机制容易产生随机插入和删除(indel)，使得在断裂点附近可能随机引入新的碱基，从而导致不精确的基因编辑。其次，CRISPR/Cas9介导的基因编辑总有一些脱靶效应[Gorski et al.,2017]。

最新研究表明，基于CRISPR/Cas9技术所构建的Cas9和脱氨酶的融合蛋白可作为“碱基编辑器(Base editor，BE)”。第一代碱基编辑(BE1)是通过将大鼠胞苷脱氨酶ApOBEC1融合到dCas9,它通过脱氨基作用将C/G碱基对改变为 A/T。此后为提高其编辑效率对BE系统进行了各种修改，目前应用较为广泛的 BE3可以在sgRNA的非结合链的位置4-8碱基的窗口中引入C-T核苷酸替换 [Komor et al.,2016]。这为实现基因敲除提供了新的思路——通过CT突变引入终止密码子，例如将CAA、CAG、CGA突变成终止密码子TAA、TAG、TGA，或通过GA突变将TGG突变成终止密码子TAA、TGA、TAG，终止编码基因的翻译，从而实现基因敲除。它提供了比Cas9介导的NHEJ更安全和更精确的敲除策略[Komor et al.,2017；Kim et al.,2017]。然而由于受到BE3编辑效率等因素的限制目前并没有通过该方法获得基因有效敲除的实例。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高效精准的基因敲除策略。

根据本发明的第一方面，提供了一种基因敲除方法，其包括：

选定待敲除基因的编码区的至少两个19～21bp-NGG目标序列，使其分别包含完整的目标密码子CAA、CAG或CGA，其中的目标单碱基C位于目标序列的第4-8位，目标密码子与NGG间隔12-14bp；

利用至少两个sgRNA序列来将BE3定位到相应的目标序列以使目标密码子中的目标单碱基C变成T从而相应引入终止密码子TAA或TAG、TGA以实现基因敲除；

所述至少两个sgRNA序列为分别与所述至少两个目标序列互补对应的 19～21bp序列，

其中所述至少两个sgRNA被共注射以实现同一基因的有效敲除。