[发明专利]一种基于血液游离核酸的检测结核分枝杆菌的试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于血液游离核酸的检测结核分枝杆菌的试剂盒，试剂盒包括PCR反应液、引物、酶和内标，引物包括检测MTB靶核苷酸引物和检测内标引物，检测MTB靶核苷酸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。本发明试剂盒的检测方法包括两种：一种是基于PCR‑荧光探针法，另一种是基于PCR‑膜层析杂交法；本发明试剂盒能实现基于血液游离核酸的高敏感性检测，显著提高痰涂片呈阴性结核患者、肺外结核患者和HIV并发结核感染患者的阳性检出率，提高对结核病感染患者筛查的准确度，检测血液样本能有效的控制传播途径，降低医务人员和检验人员的安全风险，对结核病的指导用药和疾病防控具有突破性的临床价值。

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种基于血液游离核酸的检测结核分枝杆菌的试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)简称结核杆菌或结核菌，是引发结核病(Tuberculosis,TB)的主要致病菌。结核菌为细长略带弯曲的杆菌，是无孢子形成、不动的单细胞细菌。结核病是一种慢性传染病，其可通过空气进行传播。结核病是一类严重危害人类生命健康的重要疾病：全球约有35％的人口感染结核病，每年新增的病例超过800万，超过200万人死于该类疾病。我国亦是世界上结核病高负担国家之一，现有肺结核病人约500万，每年约有数万人死于该病，TB不仅流行范围广，还具有高感染率、高发病率和高死亡率的特点。虽然随着医学技术的发展进步，不断有新的抗结核药物被发现，使得有效控制了该病的流行，但由于艾滋病与结核病双重感染及多重耐药结核菌的增多，这导致该病的发病率又呈现递增的趋势。因此，及时的早期诊断和精准治疗对结核病的防控和治愈仍旧十分关键。

目前，结核病的临床诊断主要依据病史、CT、痰涂片法、痰培养法和免疫诊断等方法，这些诊断方法存在以下不足：1)传统的“金标准”(痰培养)可以鉴别不同种类的分枝杆菌感染，但其周期长、灵敏度低，常常延误患者的最佳治疗时间；2)CT检查通常只能发现已有肺部病灶的患者，无法进行早期诊断，而且与其他肺部疾病无法区分，不能得到确诊的结果；3)痰涂片是常用的肺结核筛查技术，简单快速，但其阳性率极低，大于60％的结核病人被诊断为涂片阴性；虽然涂片阴性病人的结核菌含量较低，但其仍然是结核病重要的传染源之一，易造成漏诊；4)免疫诊断是基于特异性抗原抗体的检测方法，操作简单，但特异性和灵敏度不够。总之，缺乏一种高灵敏度、高特异性的临床诊断方法，以及后续有效的治疗方案，是结核病不能有效防控和治愈的重要原因。

分子诊断技术是近几年发展起来的诊断方法，根据病原体保守序列设计特异性的引物、探针，搭配特殊的反应体系和仪器，对致病菌进行准确的定性或定量检测，其具有高灵敏度和高特异性的特点。针对结核分枝杆菌的分子诊断产品，现市面上主要有荧光PCR产品和恒温扩增产品，其检测灵敏度介于1～10个菌/ml，通常能在3～4小时内得到检测结果，简便快速，但其也存在一些不足：1)大多数是针对新鲜痰液样本进行定性或耐药检测，而痰液样本在儿童、肺外结核患者和HIV患者中的诊断率低；2)取样难、样本间差异性大，所得检测结果的准确性低。

血液游离核酸是指外周循环血中游离于细胞结构外的小片段DNA、RNA或microRNA等核酸分子，通常是指来源于机体内细胞凋亡释放或部分降解了的内源性核酸分子；其含有重要的遗传信息。健康人血液中仅存在少量的游离核酸，不易被检测到；但在孕妇和肿瘤患者的血液中游离核酸的量会随着孕期的增加或肿瘤患者病情加重而成倍增加，利用先进的核酸提取和分子检测技术可对机体内部分遗传信息进行解读。现市面上已有多种基于血液游离核酸的分子诊断技术，如利用母体血液中胎儿游离DNA(cell free fetal DNA，cffDNA)、肿瘤患者血液中游离DNA(cell free tumor DNA，ctDNA)的无创产前筛查(NIPT)和肿瘤液体活检(liquid biopsy)技术。