[发明专利]抗Claudin18A2嵌合抗原受体、其修饰的T细胞及T细胞制备方法和用途

权利要求书

1.抗Claudin18A2嵌合抗原受体，其特征在于，包括依序连接的CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8Hinge区、 CD8跨膜区、CD28共刺激区、4-1BB共刺激区、CD3ζ信号传导区；

所述CD8αLeader的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Claudin18A2抗原结合区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述CD8 Hinge区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述CD8跨膜区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述CD28共刺激区的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述4-1BB共刺激区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述CD3ζ信号传导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.如权利要求1所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗Claudin18A2嵌合抗原受体采用包括如下步骤的方法制备得到： (1)分别按CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8Hinge区、 CD8跨膜区、 CD28共刺激区、4-1BB共刺激区、CD3ζ信号传导区合成其整个表达框并插入克隆载体pUC57上得到pUC-Claudin18A2； (2)将pUC-Claudin18A2进行双酶切，利用琼胶电泳将含有Claudin18A2DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extractionkit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的Claudin18A2 DNA片段，即所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受体。

3.表达如权利要求1所述抗Claudin18A2嵌合抗原受体的T细胞，其特征在于：所述T细胞含有如上所述抗Claudin18A2嵌合抗原受体的重组表达载体、且该T细胞敲除了PD-1基因。

4.如权利要求3所述的T细胞，其特征在于，重组表达载体采用如下步骤制备得到：分别按CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8Hinge区、 CD8跨膜区、 CD28共刺激区、4-1BB共刺激区、CD3ζ信号传导区合成其整个表达框并插入pLent-EF1α载体BamHI-NotI位点，转化到E.coli，经测序正确后，提取质粒，获得重组表达载体pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2。

5.如权利要求3所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞的制备方法包括如下步骤： S1、将T细胞的PD-1基因进行敲除后，利用磁珠分选； S2、将获得的敲除PD-1的T细胞大量扩增后，利用慢病毒颗粒对上述T细胞进行病毒感染，获得表达CAR-Claudin18A2的T细胞。

6.如权利要求1所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备治疗胃癌的药物中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述药物的形式包括试剂盒，所述试剂盒，包括 (1)获得如上所述的稳定表达抗Claudin18A2嵌合抗原受体、且敲除PD-1基因的T细胞；(2)稀释液。