[发明专利]一种检测多菌灵的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种检测多菌灵的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该试纸条包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合物释放垫上包埋有荧光微球标记的多菌灵单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有多菌灵半抗原‑载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，所述多菌灵半抗原是由2‑氨基苯并咪唑与丁二酸酐反应得到的。本发明还提供了该试纸条的制备方法及应用上述试纸条检测样品中多菌灵的方法。本发明提供的试纸条和检测方法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低的优点，能够实现对大批量样品中多菌灵的快速检测和现场监控。

技术领域

本发明属于农药残留检测领域，具体涉及一种检测烟草及烟草制品中多菌灵的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

多菌灵（Carbendazim）为苯并咪唑类杀菌剂，是一种良好的广谱、内吸性杀菌剂，对子囊菌、担子菌以及半知菌类中的大多数病原菌都有效，广泛应用于农作物、中草药、烟草等的病害防治工作中。多菌灵化学性质稳定，能被植物的种子、根和叶吸收，残效期较长，对人、畜均有一定毒性。我国针对不同作物，制定了多菌灵的最大残留限量标准，其中，多菌灵在谷物中的最大残留限量在0.05 - 2 mg/kg之间，在蔬菜中的最大残留限量在0.02 - 5mg/kg之间，在水果中的最大残留限量在0.5 - 5 mg/kg之间，在坚果中的最大残留限量为0.1 mg/kg。国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）规定烟草中多菌灵的指导性残留限量为2 mg/kg，在实际生产中，以2 mg/kg作为烟草最大残留量判定标准。

目前，国内外对多菌灵残留的检测方法主要有高效液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法。仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员进行操作和管理，无法进行现场大规模检测，时效性差，难以推广。

荧光免疫层析技术是在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，具有快速、操作简便等优点。相比传统标记物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限；而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性；形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此相比上述检测方法，荧光微球免疫层析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便、稳定性好的优点。目前尚无用于检测烟草及烟草制品中多菌灵的时间分辨荧光免疫层析试纸条。

发明内容

本发明的一个目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高、操作简便、检测快速、价格低廉的检测多菌灵的时间分辨荧光免疫层析试纸条；本发明的另一个目的是提供上述试纸条的制备方法；本发明的再一个目的是提供上述试纸条在检测多菌灵中的应用。

为了实现上述目的，本发明采取的一个技术方案是：

提供一种检测多菌灵的时间分辨荧光免疫层析试纸条，它包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合物释放垫上包埋有荧光微球标记的多菌灵单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体。

所述多菌灵单克隆抗体是以多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物是由多菌灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，所述多菌灵半抗原是由2-氨基苯并咪唑与丁二酸酐反应得到，其分子结构式为：

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所述多菌灵半抗原的制备具体包括以下步骤：