[发明专利]长链生物素标记物及其制备方法和用途

说明书

本发明公开长链生物素标记物及其制备方法和用途。本发明的长链生物素标记物包括生物素分子、间隔臂和反应基团。其中，生物素分子包括环状结构和戊酸侧链，间隔臂具有式(I)所示的结构，反应基团具有式(II)所示的结构，生物素分子中的戊酸侧链与间隔臂第一末端的NH连接，间隔臂的第二末端的氧与反应基团的磷结合形成O‑P键，从而将间隔臂与反应基团连接。本发明的长链生物标记物可用于基因的捕获测序。‑NH(CH₂)_mO‑(‑C＝O‑NH‑(CH₂‑CH₂O‑)₄)_n式(I)

技术领域

本发明涉及用于基因测序的生物标记物，具体涉及用于基因测序，特别是二代测序的长链生物素标记物及其制备方法和用途。

背景技术

二代测序在分子生物学和临床医学中起到越来越重要的作用。其中，目标区域捕获测序是二代测序应用中性价比非常高的手段，在遗传性疾病和肿瘤科学研究及临床诊断领域有着广阔的应用空间。其原理是针对感兴趣的基因组区域设计特异性的互补探针，将其与基因组DNA进行杂交，富集目标基因组区域的DNA片段，然后进行高通量测序。

捕获富集的关键步骤是把生物素修饰的单链DNA作为捕获试剂，抓到基因组中感兴趣的目标区域，然后利用链霉亲合素(streptavidin，SA)和生物素的天然特异性结合能力，与SA修饰的磁珠结合，在磁场中分离出来。

根据杂交时的状态可将区域捕获分为固相杂交法和液相杂交法。固相杂交法所用的探针通常都是固定在固体支持物上，例如基因芯片。杂交后先洗脱未杂交上的DNA片段，再将与探针杂交的DNA洗脱下来。现在更加流行的是液相杂交。与固相杂交最大的差异的是液相杂交在溶液中使目标DNA片段和带有生物素标记的探针直接杂交。目前采用该技术公司包括主要是国外生物科技公司。如安捷伦、罗氏、赛默飞等等。

现有的生物素修饰可通过加入生物素修饰的dUTP(Deoxyuridine Triphosphate脱氧尿苷三磷酸)进行复制的方法随机掺杂在DNA链上。生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强。生物素分子有两个环状结构，其中咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位；另外一个噻吩环的C2上有一戊酸侧链，可以提供一定的空间距离，但是这种侧链长度并不足够。因此，生物素和DNA一般通过有机长链状分子连接，从而调节其距离。通常采用的有己烷链、三甘醇(TEG)链或者其他长度的链等，例如，DNA复制时掺入的Biotin-16-dUTP(CASnumber 136632-31-0)采用了16个原子长度的有机分子链。然而，这些有机长链并不能完全满足当前的需求，特别是在二代测序方面的需求。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明研究了生物素分子和寡核苷酸之间的有机长链结构对于二代测序中的探针捕获的影响，发现具有特定结构的长链生物素分子特别适合于二代测序，并且在特定链长范围内，捕获效率逐步提高。至少部分地基于上述内容完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种长链生物素标记物，其包括生物素分子、间隔臂和反应基团，其中，所述生物素分子包括环状结构和戊酸侧链，所述间隔臂具有式(I)所示的结构，所述反应基团具有式(II)所示的结构，所述生物素分子中的戊酸侧链与间隔臂第一末端的NH连接，所述间隔臂的第二末端的氧与所述反应基团的磷结合形成O-P键，从而将所述间隔臂与所述反应基团连接，

-NH(CH₂)_mO-(-C＝O-NH-CH₂-CH₂O)_n- 式(I)

式(I)中m和n分别独立地表示1-10的整数，

在某些实施方案中，本发明的长链生物素标记物中的生物素分子受DMT基团保护。