[发明专利]一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法

说明书

本发明涉及一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法，属于细胞生物学技术和再生医学领域，取外周血多潜能间充质基质细胞进行原代培养，得到第三代细胞；将第三代传代外周血多潜能间充质基质细胞与人关节软骨细胞按共在诱导培养基中培养，本发明采用的一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法，外周血多潜能干细胞和软骨细胞共培养，两种细胞相互促进增殖和分化，可减少软骨细胞增殖传代次数并节省软骨细胞数量，提高了分化率，对建立种子细胞源是提供一种高效的方法，也为扩大软骨组织工程的细胞源提供了一种新的医学实验根据。

技术领域

本发明涉及一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法，属于细胞生物学技术和再生医学领域。

背景技术

软骨组织(Cartilage tissue)是一种富含蛋白多糖、胶原和透明质酸等物质的组织，由软骨细胞和软骨基质构成，在体内主要起支撑和减少摩擦的作用。但软骨组织缺乏血管，因此，软骨组织一旦受到损伤便很难修复，即便是微小的软骨组织损伤，也很难自然修复。目前，临床上用于软骨组织损伤修复的方法主要有软骨和软骨下骨去除、微骨折和软骨下骨钻孔、自体骨软骨移植和同种异体骨软骨移植、软骨或骨膜移植等。这些方法在一定程度上均能够对软骨组织损伤进行修复，但均存在明显缺点，如微骨折和软骨下骨钻孔方法能够使干细胞到达损伤部位，但因局部环境和机械应力不同，干细胞很难向软骨细胞分化；自体骨软骨移植安全、有效，但会给患者带来新的创伤；异体骨软骨移植避免了自体骨软骨移植给患者带来的新的创伤，但存在供体来源限制、免疫排斥反应和疾病传播风险等。目前研究发现采用外周血多潜能细胞诱导培养软骨细胞是一种非常具有潜力的技术，但是研发发现，外周血多潜能细胞的分离培养条件十分复杂因此外周血多潜能细胞诱导的形成效率低。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法。

具体技术方案为：

一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法，包括以下步骤：

(1)外周血加入枸橼酸钠抗凝液，然后将外周血加入到质量浓度0.9％氯化钠注射液中，再加入质量浓度6％羟乙基淀粉，摇匀后静置；

待分层后吸取上层细胞液，分离得到浓缩液，浓缩液用生理盐水稀释，然后铺在由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的分层液上面，然后离心收集分离出的干细胞层，用生理盐水清洗干细胞得到外周血多潜能间充质基质细胞；

取外周血多潜能间充质基质细胞进行原代培养，原代培养采用的培养基，包括，人类间充质干细胞无血清培养基，还包含的胎牛血清的质量浓度为8％～15％，氨苄青霉素浓度为100～120U/mL、链霉素双抗的浓度为50～100U/mL，成纤维细胞生长因子的浓度为8～13μg/L，阿米卡星的浓度为5～8mg/L；

待细胞贴壁后，用胰蛋白酶消化离心，得到原代外周血多潜能间充质基质细胞；

(2)外周血多潜能间充质基质细胞用胰蛋白酶消化处理后，得到的原代细胞置于新的培养基中进行传代培养，培养温度为37℃，环境空气为5％CO₂；待细胞长至80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化处理，然后离心分离，得到第二代细胞；

(3)第二代细胞置于新的培养基中进行传代培养，培养温度为37℃，环境空气为5％CO₂；待细胞长至80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化处理，然后离心分离得到第三代传代外周血多潜能间充质基质细胞；

(4)将所述的第三代传代外周血多潜能间充质基质细胞与第二代人关节软骨细胞按1∶1的比例接种，共在诱导培养基中培养，诱导培养时间为21天，每3天更换一次诱导培养基。