[发明专利]一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法

权利要求书

1.一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取外周血多潜能间充质基质细胞进行原代培养，原代培养采用的培养基，包括，人类间充质干细胞无血清培养基、胎牛血清、氨苄青霉素、链霉素、成纤维细胞生长因子、阿米卡星，待细胞贴壁后，用胰蛋白酶消化离心，得到原代外周血多潜能间充质基质细胞；

(2)外周血多潜能间充质基质细胞用胰蛋白酶消化处理后，得到的原代细胞置于新的培养基中进行传代培养，待细胞长至80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化处理，然后离心分离，得到第二代细胞；

(3)第二代细胞置于新的培养基中进行传代培养，待细胞长至80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化处理，然后离心分离得到第三代传代外周血多潜能间充质基质细胞；

(4)将所述的第三代传代外周血多潜能间充质基质细胞与人关节软骨细胞共在诱导培养基中培养，诱导分化为软骨细胞。

2.根据权利要求1所述的一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述外周血多潜能间充质基质细胞，通过以下方法获得，外周血加入枸橼酸钠抗凝液，然后将外周血加入到质量浓度0.9％氯化钠注射液中，再加入质量浓度6％羟乙基淀粉，摇匀后静置；

待分层后吸取上层细胞液，分离得到浓缩液，浓缩液用生理盐水稀释，然后铺在由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的分层液上面，然后离心收集分离出的干细胞层，用生理盐水清洗干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的第三代传代外周血多潜能间充质基质细胞与人关节软骨细胞按1∶1的比例接种。

4.根据权利要求1所述的一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的人关节软骨细胞为第二代人关节软骨细胞。

5.根据权利要求1所述的一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的诱导培养基，以高糖DMEM为基础培养基，还包括以下物质：鱼卵母细胞提取物、牛胰岛素、地塞米松、丙酮酸钠、TGF-β3、牛血清白蛋白、脯氨酸、抗坏血酸、转铁蛋白、5硒酸、亚油酸。

6.根据权利要求5所述的一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法，其特征在于，所述的鱼卵母细胞提取物，采用鲫鱼卵黄充满时相时期的鱼卵，鱼卵在无菌和低温条件下取出，鱼卵进行匀浆，再用等体积的DMEM稀释、搅拌，然后冻存、解冻、离心，收集上清液，经过滤除菌后得到鱼卵母细胞提取物。

7.根据权利要求1所述的一种提高外周血多潜能细胞向软骨细胞分化的培养方法，其特征在于，步骤(4)中，诱导分化成软骨细胞的诱导培养时间为21天，每3天更换一次诱导培养基。