[发明专利]一种半滑舌鳎性别差异指示标签microRNA的应用

说明书

本发明涉及一种半滑舌鳎性别差异指示标签microRNA的应用，属于鱼类生物技术领域，所述microRNA性别标签为sdre‑miR‑141‑3p，其序列为TAACACTGTCTGGTAACGATGC；以解决半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼在生殖遗传差异的区分问题。本标志miRNAs具有在雄鱼和伪雄鱼中显著差异表达的特点，是特异的分子识别标记。

技术领域

本发明属于鱼类生物技术领域，特别是海水鱼精液外泌体标志物应用领域。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国海域特有的近海底栖鱼类，同时因其味道鲜美、营养丰富也是重要的名贵海水养殖鱼类。

半滑舌鳎作为比目鱼，雌、雄鱼生长速度差异巨大，雌性的生长速度是雄性的2-4倍。半滑舌鳎雄鱼生长慢、个体小的特点，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，半滑舌鳎养成中雄性比例甚至可以达到80％—90％。研究发现在80％—90％比例的雄鱼中，有相当一部分是伪雄鱼。半滑舌鳎正常雄鱼具有ZZ型的染色体，正常雌鱼具有ZW型的染色体。而伪雄鱼遗传的是雌性染色体，但从它生理上表现的是雄性特征。也就是伪雄鱼的染色体和雌鱼一样，都是ZW型，而它的体貌特征和生殖器官都和雄鱼一样，也可以像雄鱼一样产生可以受精的精子且繁育后代。而且如果用伪雄鱼作为父本，那么后代也会遗传父亲的特征成为伪雄鱼，通过这种逐代积累，就导致了半滑舌鳎雌雄比例的失衡。雄鱼越来越多，雌鱼越来越少。那么雄鱼和伪雄鱼除了基因和染色体水平有差别外，还有没有其他差别？本发明针对这个问题，开发了针对半滑舌鳎精液来源的外泌体提取及识别应用的方法，用以解决半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼生殖遗传差异的区分问题。

外泌体直径为30-120nm，是细胞外泌囊泡中体积较小的一种，广泛存在于动物体液内，包含不同的生物分子，如脂质，蛋白质和核酸。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。目前已经研究证实外泌体中存在多种18-23bp的小分子microRNAs，其在进化上高度保守，性质稳定，易于定量检测，且存在生理、病理及来源特异性，具有生物标志物的特性，在生物分子标记应用中具有重要的价值。

然而，在海洋动物中外泌体来源的microRNAs作为生物标志物的研究相对较少，本发明开发了针对以半滑舌鳎为代表的海水鱼精液来源的外泌体提取及初步应用的方法，解决了半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼精液外泌体的生物标记物差异识别的问题，具有创新性。

发明内容

本发明的目的是针对半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼识别问题，提出一种半滑舌鳎精液来源的外泌体microRNAs作为生物标记物识别雄鱼及伪雄鱼的方法。

本发明是采取以下技术方案实现的：

半滑舌鳎精浆外泌体microRNA在性别鉴定中的应用，microRNA性别标签为dre-miR-141-3p，其序列为TAACACTGTCTGGTAACGATGC。

本发明还提供一种所述microRNA性别标签的筛选方法如下：

1)精浆外泌体分离鉴定后，对精浆外泌体smallRNA进行测序分析，将clean reads依次和Rfam数据库、cDNA序列、物种重复序列库、miRBase数据库对测序结果中的smallRNA进行分类注释；将分类注释后的序列和miRBase数据库比对，进行已知microRNA的统计；使用未注释上的序列进行新的microRNA预测，microRNA差异表达分析，差异表达miRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后与样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对两种样品具有指示作用的microRNA作为候选microRNAs生物标记物；