[发明专利]一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB及其鉴定方法

权利要求书

1.一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB，其特征在于：所述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB，含一个663bp的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB，其特征在于：所述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB编码的蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB，其特征在于：所述的基因和蛋白通过功能互补实验，证明了基因yigB能够恢复大肠杆菌盐敏感突变株KNabc的耐盐碱能力；利用硫氰酸汞分光光度法，测出YigB具有L-2-卤代链烷酸脱卤酶活性；利用原子吸收光谱技术，进一步确定了基因yigB具有维持细胞内的Na⁺平衡的功能；利用荧光猝灭恢复技术，排除了YigB是Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的可能性，结合蛋白印迹杂交实验与跨膜区预测的结果，推测YigB极可能是一种膜结合蛋白。

4.一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)通过基因文库与基因功能互补相结合的筛选技术，从喜盐芽胞杆菌中获得含有耐盐碱相关的基因片段，所述的耐盐碱相关的基因片段中含有一个长663bp的yigB基因的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；

(2)构建含有yigB基因的原核表达载体；

(3)通过化转异源宿主Escherichia coli KNabc，将基因yigB热击化转的方法导入至KNabc宿主中，对基因yigB生理功能及编码的蛋白进行分析鉴定。

5.根据权利要求4所述的喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB的鉴定方法，其特征在于：yigB基因的亚克隆：

通过对原始克隆的重组质粒pUC-SL40进行酶位点分析，利用位于第1508的HindIII酶切位点和第2461的BamHI酶切位点，去除不完整的ORF1，然后胶回收段与pUC18进行连接，构建亚克隆重组质粒pUC-YigB，后化转盐敏感缺陷株KNabc，以检测ORF2的耐盐能力，并通过提取重组质粒，HindIII、BamHI双酶切验证，确保亚克隆构建成功。

6.根据权利要求5所述的喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB的鉴定方法，其特征在于，构建含有yigB基因的原核表达载体，包括原核表达载体pET19b-yigB；所述原核表达载体pET19b-yigB的构建方法包括：

(1)根据yigB基因序列，首先利用Primer5软件设计yigB-F/yigB-R特异引物，并在基因的5’和3’端分别引入Nde I、BamHI两个酶切位点，然后进行yigB基因的PCR扩增，对yigB基因进行亚克隆；

(2)将PCR扩增产物加A纯化后连接到克隆载体pEASY-T3上，化转到Trans1-T1感受态细胞中，将转化产物进行蓝白斑筛选；

(3)用限制性内切酶进行酶切鉴定pEASY–yigB重组质粒；为进一步确定序列的准确性，对连接到克隆载体pEASY-T3上的插入片段进行测序；

(4)yigB亚克隆NdeI-BamHI建到pET19b,获得重组质粒pET19b-yigB,对插入盐芽孢杆菌耐盐碱基因yigB片段进行双酶切验证，酶切结果正确的质粒进行基因测序。

7.一种如权利要求1所述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB的用途，其特征在于：所述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB用于构建的具有较高的脱卤酶活性的蛋白。

8.一种如权利要求1所述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB的用途，其特征在于：所述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB用于构建的耐盐碱工程菌株。

9.一种如权利要求1所述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB的用途，其特征在于：所述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB用于制备开发微生物肥料。

10.一种如权利要求1所述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB的用途，其特征在于：所述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB用于制备耐盐碱性的转基因植物。