[发明专利]一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR-TKI敏感突变的方法

说明书

本发明公开了一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR‑TKI敏感突变的方法。该方法的具体步骤如下：(1)通过常规细胞外囊泡EVs提取方法，对肿瘤患者体液中细胞外囊泡EVs进行提取，得到细胞外囊泡EVs；(2)通过表面活性剂的作用，使细胞外囊泡EVs结构破坏，释放出DNA，通过常规DNA提取的方法，得到目标DNA；(3)通过常用EGFR‑TKI灵敏突变检测的方法进行检测。本发明方法用于检测EGFR突变，结果准确，灵敏度和特异性高。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR-TKI敏感突变的方法。

背景技术

表皮生长因子受体EGFR(epidermal growth factor receptor)在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR锚定在细胞膜上，并通过络氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)向下传导信号的作用。EGFR在肿瘤的发生中起重要作用，针对EGFR-TK的靶向抑制剂(EGFR-TK inhibitor,EGFR-TKI)，阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增殖、转移以及血管生成等，促进肿瘤细胞的凋亡。但是，并不是所有肿瘤细胞对EGFR-TKI都有反应，只有当EGFR基因18-21外显子发生EGFR-TKI敏感突变时，EGFR-TKI才会发挥较好的肿瘤抑制作用，这类突变占整个东亚人群的～45％。当肿瘤细胞不携带EGFR-TKI敏感突变时，EGFR-TKI类药物的有效率将低至10％。因此，在临床实践中，检测EGFR-TKI敏感突变，对于治疗方案的选取具有重要意义。

目前检测EGFR-TKI敏感突变的DNA来源主要包括组织DNA和外周血cfDNA等。然而，这些DNA来源样本存在较多不足之处。对于组织DNA来说，虽然可以通过组织活检、或者手术得到较多的组织，并提取到足量的DNA。但是，其缺点也非常明显，对于许多无法获得组织样本的患者而言，就无法获得足量DNA进行检测。另外，由于癌症组织异质性的特点，即使得到癌症组织，也仍然存在较大可能得不到有效的目标DNA。外周血cfDNA虽然可以弥补癌症组织来源DNA的不足，但是由于ctDNA在cfDNA中占比非常少，并且容易受到血液中其他物质的干扰，因此，在实际应用中存在灵敏度和特异性较低的情况。

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)具有磷脂双分子层结构，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体等。研究证实，EVs可作为信使，通过血液、尿液、乳汁以及唾液等途径介导细胞间的信号的传导。虽然EVs的形成机理仍然不是特别清楚，但是研究发现，EVs携带各种蛋白、核酸，甚至全基因组的DNA。所以，EVs内容物在一定程度上反映了肿瘤的相关信息，针对肿瘤检测而言是一种潜在的肿瘤分子标志物，并且研究发现，肿瘤组织释放外泌体等EVs的量远高于正常组织。因此，利用EVs所含DNA检测EGFR-TKI敏感突变具有较高实用价值。

发明内容

为了克服现有检测DNA样本来源的缺点，本发明的目的在于提供一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR-TKI敏感突变的方法。本发明使用EVs中所含有的DNA，进行EGFR-TKI敏感突变检测，其能有效的获得足量的目标DNA，进而对EGFR-TKI进行敏感突变检测，其检测灵敏度和特异性高。

本发明的技术方案具体介绍如下。

一种基于细胞外囊泡DNA检测EGFR-TKI敏感突变的方法，具体步骤如下：

(1)通过常规细胞外囊泡EVs提取方法，对肿瘤患者体液中细胞外囊泡EVs进行提取，得到细胞外囊泡EVs；

(2)通过表面活性剂的作用，使细胞外囊泡EVs结构破坏，释放出DNA，通过常规DNA提取的方法，得到目标DNA；

(3)通过常用EGFR-TKI灵敏突变检测的方法进行检测。

本发明中，步骤(1)中，常规细胞外囊泡EVs提取方法包括超速离心法、PEG沉淀法和成品试剂盒。