[发明专利]猪圆环病毒3型微滴数字PCR检测引物和探针及其应用

说明书

本发明属于分子检测技术领域，具体公开了猪圆环病毒3型微滴数字PCR检测引物和探针及其应用。本发明对所有已知的183条PCV3的cap基因序列进行分析比对，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计(具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示)，避免了假阴性结果的产生。本发明提供的引物和探针对不含PCV3的检测样本均无扩增信号出现，表明其具有良好的特异性。本发明提供的引物和探针可实现对PCV3的精准检测，灵敏度可达到1.6个拷贝。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，更具体地，涉及猪圆环病毒3型微滴数字PCR检测引物和探针及其应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)为一种共价闭合、单股环状DNA病毒，是迄今发现的最小的动物病毒。2016年之前，在全球范围内只发现PCV1和PCV2两个基因型。

2003年左右，全球范围内PCV2发生由PCV2a向PCV2b基因型转变，伴随着病毒致病力增强和对养猪业危害加重。2012年前后，PCV2在世界范围内再次发生基因型转变，由PCV2b向致病力更强的PCV2d转变，导致以PCV2a、PCV2b为免疫原的疫苗的免疫效果降低。2015年，新闻报道的猪皮炎肾病综合征(Porcine Dermatitis and NephropathySyndrome,PDNS)疫情，患病母猪出现厌食症状，皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有相似的临床症状。2016年，堪萨斯州立大学的Palinski等借助新一代测序(NGS)技术，从患病母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新的病毒。鉴于该病毒与圆环病毒科的病毒具有类似的基因组结构和遗传相似性，但与其他圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列同源性低于70％，根据国际病毒分类委员会(ICTV)对圆环病毒的分类标准，将其归类为一种新型圆环病毒，并命名为猪圆环病毒3型(PorcineCircovirus 3，PCV3)。

截至目前为止，美国多个州的猪群被证实存在PCV3感染，如北卡罗来纳州和爱荷华州等，但目前尚不清楚其他州是否也存在PCV3感染与流行。另外，有研究报道从我国湖北、广东某些发生繁殖障碍的母猪以及急性死亡的仔猪体内检测出PCV3。截至目前，我国已有13个省/直辖市的猪场存在PCV3感染与流行，且主要分布于中东部地区，至于其他省市是否也存在PCV3感染目前还不得而知。近来，Stadejek等对波兰境内的14个商品化猪场的母猪、仔猪和育成猪的血清进行PCV3检测，首次证实欧洲地区也存在PCV3感染。Kwon等对采自韩国6个省73个猪场的猪口水样品进行PCV3核酸检测，首次发现韩国猪群也存在PCV3感染与流行。

猪为PCV3的主要易感动物，不同年龄、性别和品种的猪只均可感染，且以妊娠母猪和仔猪更易感。目前，尚不清楚野猪是否对PCV3易感，也未发现其他物种感染PCV3的报道。

鉴于PCV3是从患有PDNS症状的母猪及其流产胎儿体内所能检出的唯一病原体，且PCV3感染猪的临床症状与病理变化与PCV2高度相似，因此，仅依靠临床诊断很难做出准确判断，必须结合实验室诊断才能确诊PCV3感染。目前已报道的实验室诊断方法主要包括病毒分离与鉴定、DNA测序、免疫组化(IHC)、ELISA、荧光定量PCR和RPA等。荧光定量PCR(qPCR)检测方法是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一条特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的扩增技术。其操作简便、特异性强、灵敏度高，因此被广泛应用于各种病毒的检测。然而qPCR方法需要依赖内参基因或标准物质，只能进行相对定量，且对低浓度病毒的定量结果较不稳定，无法在病毒感染的早期实现精准检测。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供猪圆环病毒3型微滴数字PCR检测引物和探针及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种猪圆环病毒3型微滴数字PCR检测引物，包括：