[发明专利]一种非病毒载体共表达IL18的CAR-T细胞构建及其应用

说明书

本发明公开了一种共表达IL18的CD19特异性嵌合抗原受体T细胞的制备方法。本发明通过将含有CD19 CAR和IL18的睡美人质粒转座系统转染入T细胞中，同时加入特定剂量的IL2和anti‑CD3/CD28磁珠抗体，从而获得共表达IL18的CD19 CAR‑T细胞。所得的T细胞能够特异性地杀伤肿瘤细胞，同时表达的IL18能够显著增加T细胞的杀伤效果。

技术领域

本发明涉及免疫细胞制备领域，具体地，本发明涉及一种IL-18共表达于CD19特异性嵌合抗原受体T细胞及其用途。

技术背景

嵌合抗原受体T细胞治疗(Chimeric antigen receptor T cell therapy,CAR-Ttherapy)是一种新兴的肿瘤免疫治疗，该疗法是通过对患者体内的T细胞进行改造，在T细胞膜上表达一种肿瘤特异性的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptors,CARs)，使其能够通过肿瘤特异性的、非MHC分子依赖性的途径激活，从而发挥抗肿瘤作用。CAR是一种跨膜受体，主要由胞外识别结构域、跨膜区和胞内激活结构域组成，其胞外识别结构域通常为肿瘤细胞特征性表面分子的单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)，胞内激活结构域为T细胞受体(T cell receptor,TCR)的CD3ζ，当CAR胞外的单链抗体与肿瘤细胞识别、结合，即可激活CD3ζC，进而直接激活T细胞。

至今已发展出三代CAR，其中第二代CAR是研究最多、最具应用前景，第二代CAR分子在跨膜区和激活结构域之间还偶联了一个T细胞共刺激分子，如CD28、4-1BB等，在共刺激分子的协同作用下，CAR-T细胞表现出更持久的增殖能为和更强的抗肿瘤功能。

近年来，改造CAR-T细胞使其表达某些细胞因子，可对CD8+T细胞的功能、生存和分化有促进作用，这些因子包括IL-12、IL-15、IL-7和IL21等，如在CAR分子上偶联某种细胞因子如IL-15，使细胞因子与CAR共表达于T细胞，也能显著提高T细胞的体内、体外生存和杀伤靶细胞的能力。与外源性细胞因子相比，CAR-T细胞共表达的细胞因子只作用于肿瘤局部微环境，无血液稀释的影响，并且不会对正常组织带来副作用。

细胞因子IL18是一种具有抗肿瘤活性的蛋白质，IL-18可作用于T、B以及NK细胞等效应细胞的增殖与分化，促进IFN-γ的表达和克里梅的释放，从而发挥其抗肿瘤功能。IL-18和IL12也可直接作用于CD8+T细胞和NK细胞，诱导其产生更多的IFN-γ、释放颗粒酶B、表达FasL，从而进一步杀伤肿瘤细胞。同时，IL18因其相对低毒的特性以及和传统疗法的的协同作用引人注目。

目前，将细胞整合进T细胞的方式包括病毒载体和非病毒载体两种方式。其中病毒载体虽然可以较高的拷贝数整合入宿主细胞基因组，但病毒载体的制备具有一定难度，特别是大规模制备；且慢病毒也有安全性的潜在风险。睡美人转座子(Sleeping Beaut,SB)作为表达非病毒载体结构简单，操作容易，能插入大片段核酸序列，并且成本相较慢病毒很低。有研究表明，SB介导的基因修饰T细胞能在体外扩增2,200至2,500倍，CAR表达率可达84％，未发现有整合热点存在，说明SB转座子/转座酶系统极具CAR-T细胞的临床应用潜力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，通过将含有CD19 CAR和IL18的睡美人质粒转座系统转染入T细胞中，同时加入特定剂量的IL2和anti-CD3/CD28磁珠抗体，从而获得共表达IL18的CD19 CAR-T细胞，并证明其在实体瘤治疗中的潜在应用。具体的说，本发明提供一种共表达IL18的CD19 CAR-T细胞的构建方法，并赋予T细胞杀伤带有CD19靶点肿瘤细胞的能力。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：