[发明专利]一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因通用扩增引物及其筛选方法

说明书

本发明公开了一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因通用扩增引物及其筛选方法。所述的通用扩增引物为：16ST‑F：5’‑CCTTAAAGTAGCGTGATA‑3’；16ST‑R：5’‑GATCCTTTCGTACGAGAG‑3’。本发明筛选出一对用于我国南方海区砗磲线粒体部分16S序列的通用扩增引物16ST‑F和16ST‑R，并确定了其反应体系和PCR扩增条件，经试验证明该引物具有条带单一、扩增效率高的特点，能够满足我国南方海区砗磲物种的物种鉴定、系统发育关系分析等研究的需求。

技术领域：

本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种适合于中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因通用扩增引物及其筛选方法。

背景技术：

砗磲隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)，帘蛤目(Veneroida)，砗磲科(Tridacnidae)，是一类热带大型海洋珊瑚礁底栖贝类，也是海洋中最大的双壳贝类。目前世界上发现的砗磲科物种共2个属共10种，在中国南部沿海分布有7种，分别有砗磲属的库氏砗磲(Tridacan gigas)、无鳞砗磲(Tridacna derasa)、鳞砗磲(Tridacna squamosa)、长砗磲(Tridacna maxima)、诺瓦砗磲(Tridacna noae)、番红砗磲(Tridacna crocea)以及砗蚝属的砗蚝(Hippopus hippopus)。砗磲属于高经济价值物种，是热带海洋生物和渔业经济的物质基础，提供水族观赏、工艺材料、水产食品等资源。另外砗磲也是珊瑚礁关键框架生物，在维护生态系统功能方面具有重要的生态价值。

利用分子技术对物种进行分类、鉴定和系统发育分析已成为一种有效方法。线粒体16S rRNA基因已成为物种鉴定和系统发育关系分析的理想标记，并在很多物种中得到了成功应用，利用16S rRNA基因对砗磲科物种进行物种鉴定和系统发育关系分析具有良好的应用价值。有关砗磲线粒体16S rRNA基因引物方面，周智等2017年公开了一种砗磲16SrRNA基因的通用正向引物，但其反向引物是针对不同砗磲物种分别设计的特异性引物，因此不能用于7种砗磲物种的通用扩增(申请号：201610966874.1)。另外，尽管砗磲科线粒体16S rRNA基因序列在种内比较保守，但在种间和属间变异度很大，因此针对我国南方海区的砗磲种类设计相关通用引物对于其物种鉴定和系统发育关系分析具有重要的意义，同时也为砗磲的种质资源保护提供支持。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因通用扩增引物及其筛选方法。

本发明的第一个目的是提供一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因的通用扩增引物，包括以下引物：

16ST-F：5’-CCTTAAAGTAGCGTGATA-3’(如SEQ NO.1所示)；

16ST-R：5’-GATCCTTTCGTACGAGAG-3’(如SEQ NO.2所示)。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定中国南方海区砗磲科物种的试剂盒，包括所述的通用扩增引物。

本发明的第三个目的是提供所述的中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因的通用扩增引物的筛选方法，包括以下步骤：将库氏砗磲、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和/或番红砗磲与砗蚝的16S rRNA基因序列进行比对分析，确定16S rRNA基因5’端和3’端的保守区域；在保守区域设计多对引物并进行合成；提取库氏砗磲、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲、番红砗磲和砗蚝的基因组DNA作为模板，利用合成的引物分别对其进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出在库氏砗磲、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲、番红砗磲和砗蚝都可以扩增出目的条带、条带单一、扩增效率高的一对引物16ST-F和16ST-R；

所述的引物16ST-F和16ST-R的序列如下：