[发明专利]一种CART细胞制备方法

说明书

本发明提供了一种一种方法培养嵌合抗原受体T细胞，以及培养后进行放行检测。本发明制备的CART细胞扩增效率高,均一度高。本发明的节省了retronectin的用量，能达到同样的病毒感染效果，节约了制备CART细胞成本为CART的产业化生产奠定基础。

技术领域

本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种CART细胞制备方法。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。

嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

在CART细胞构建过程中需要用到RetroNectin，提前用RetroNectin包被细胞培养。RetroNectin是重组人纤维蛋白片段FN CH-296，包括细胞结合域，肝磷脂结合域和CS1位点三个功能区域。它由574个氨基酸组成，分子量63kDa。RetroNectin能够大幅地提高逆转录病毒感染哺乳动物细胞的感染效率，其作用原理是：细胞表面VLA-4及VLA-5可分别与RetroNectin上的CS-1位点及细胞结合域结合，逆转录病毒载体可以与肝磷脂结合域结合。在经RetroNectin包被的培养容器表面，细胞与病毒载体以高浓度共存，从而提高基因转染效率。RetroNectin重组人纤维蛋白片段和激发型CD3单抗可分别与T淋巴细胞上的VLA和TCR结合，两者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，通过Ras途径刺激T细胞的增殖和分化，使其获得上千倍的增殖。RetroNectin市售价格昂贵，本发明在不改变其功能的基础上，重点解决生产CART细胞成本问题。

发明内容

本发明的一个方面提供了一种方法培养嵌合抗原受体T细胞，以及培养后进行放行检测。

本发明的另一方面提供了嵌合抗原受体T细胞培养方法，包括：

(Ⅰ)T细胞的分离活化；

(Ⅱ)病毒感染活化的T细胞；

(Ⅲ)CART细胞的扩大培养；

(Ⅳ)培养后的CART细胞放行检测。

优选的是，T细胞分离，所述方法包括Ficoll梯度离心法。

优选的是，T细胞活化，所述方法包括用CD3/CD28抗体活化T细胞或CD3/CD28磁珠活化T细胞。

优选的是，病毒感染T细胞，所述方法病毒包括逆转录病毒，慢病毒，优选含有所述逆转录病毒载体。

本发明的第三方面提供了病毒感染T细胞，所述方法包括用Retronectin包被培养板，Retronectin所用剂量为500微升每孔、200微升每孔，优选含有200微升每孔的Retronectin。

本发明的第四方面提供了CART细胞的扩大培养，所述方法用IL-2作为CART细胞生长因子，持续添加在细胞培养液中，剂量为500IU/ml。