[发明专利]抗Her2/PD-1双特异性抗体及其制备方法在审
| 申请号： | 201810888976.5 | 申请日： | 2018-08-07 |
| 公开（公告）号： | CN109021110A | 公开（公告）日： | 2018-12-18 |
| 发明（设计）人： | 刘金涛;宋莉 | 申请（专利权）人： | 苏州塞恩塔生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C07K16/46 | 分类号： | C07K16/46;A61K39/395;A61P35/00 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人： | 林娟 |
| 地址： | 215000 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 双特异性抗体 制备 抗肿瘤免疫反应 生物技术领域 信号传导途径 增强免疫 有效地 | ||
1.一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以pCHO1.0为表达载体，构建分别表达抗Her2单克隆抗体、表达抗PD-1单克隆抗体的中华仓鼠卵巢细胞工程菌细胞株；
(2)培养所述工程菌细胞株，分别产抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体；
(3)将抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体组装，形成Her2/PD-1双特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，所述抗Her2单克隆抗体的重链、轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，所述抗PD-1单克隆抗体的重链、轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，步骤(2)培养工程菌细胞株的方法，是将二级种子细胞按(1.0±0.3)×106个/ml的接种密度稀释至3L细胞培养反应器中，3L细胞培养反应器中装有1L的基础培养基，设置搅拌转速为250～280r/min，pH设置为6.95±0.15，通过碳酸氢钠溶液和CO2调节pH；溶解氧设置为40±20％；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃；培养第5天降温至33.5±0.5℃；培养第14天收获；第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补加补料培养基A和补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，当葡萄糖浓度低于2.0～3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至4.0～5.0g/L。
5.根据权利要求4所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，所述基础培养基是Dynamis AGT 24.8g/L；所述葡萄糖浓缩液是200g/L的葡萄糖溶液；所述补料培养基A是CHO CD EfficientFeed A；所述补料培养基B是CHO CDEfficientFeed B。
6.根据权利要求4所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，步骤(2)还包括对抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体进行纯化的过程，是将工程菌的培养上清进行深层过滤去除细胞，收获澄清液，采用GE MabselectedSure填料，亲和纯化抗Her2抗体和抗PD-1抗体。
7.根据权利要求1～6任一所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，步骤(3)将纯化后的抗Her2抗体和抗PD-1抗体按照1：1比例混合，添加精氨酸和还原性谷胱甘肽至终浓度分别为10～200mM和60～140mM，用Tris调节pH至7.5～8.5，37℃孵育3～5小时。
8.根据权利要求1～7任一所述方法制备得到的抗Her2/PD-1双特异性抗体。
9.权利要求8所述的抗Her2/PD-1双特异性抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
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